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einorain木蟲 (小有名氣)
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HPLC法校正因子研究中的幾個(gè)問(wèn)題 （引自CDE網(wǎng)站） 已有3人參與
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發(fā)布日期 20111207 欄目 化藥藥物評(píng)價(jià)>>化藥質(zhì)量控制 標(biāo)題 HPLC法校正因子研究中的幾個(gè)問(wèn)題 作者 張哲峰 部門 化藥藥學(xué)二部 正文內(nèi)容 HPLC法具有將不同物質(zhì)分離后逐一定量的分離分析能力，在藥品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，成為藥品雜質(zhì)控制中常用而有效的手段之一。在雜質(zhì)對(duì)照品法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法、峰面積歸一化法等幾種常用的雜質(zhì)定量方式中，校正因子的研究對(duì)于選擇合適定量方式，準(zhǔn)確定量雜質(zhì)具有重要意義，因而成為雜質(zhì)分析方法研究中的重要內(nèi)容之一。但從目前注冊(cè)申報(bào)資料實(shí)際情況來(lái)看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要進(jìn)一步思考和關(guān)注的問(wèn)題。 1.校正因子的定義及特點(diǎn) 一般來(lái)講，HPLC定量測(cè)定中，物質(zhì)的檢測(cè)量W與色譜響應(yīng)值（峰面積等）A之間的比值稱為絕對(duì)校正因子，即單位響應(yīng)值（峰面積等）所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物質(zhì)的量（濃度或質(zhì)量）；而某物質(zhì)i與所選定的參照物質(zhì)s的絕對(duì)校正因子之比，即為相對(duì)校正因子，即通常所講的校正因子。 目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身對(duì)照法”定量相關(guān)特定雜質(zhì)，這種定量方式因考慮了雜質(zhì)與主成分的絕對(duì)校正因子的不同所引起的測(cè)定誤差，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的賦值信息轉(zhuǎn)化為常數(shù)，固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，且不需長(zhǎng)期提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因而成為現(xiàn)階段雜質(zhì)控制較為理想可行的手段。但這種方法有時(shí)會(huì)因不同儀器及色譜條件的波動(dòng)，可產(chǎn)生一定范圍的誤差，需進(jìn)行充分的方法耐用性驗(yàn)證，并結(jié)合色譜峰定位控制等措施，將誤差控制在一定范圍內(nèi)。 2.校正因子的測(cè)定 在校正因子的研究和使用中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、色譜條件、溶劑、檢測(cè)波長(zhǎng)等均是重要的影響因素，研究中需要予以關(guān)注。 2.1 校正因子的測(cè)定需要用到特定雜質(zhì)及主成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)具備量值準(zhǔn)確的特點(diǎn)，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對(duì)照品）的相關(guān)要求；其次，確定校正因子的分析方法應(yīng)與最終確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法一致，色譜條件等需經(jīng)篩選優(yōu)化后確定，如有變更，需考慮對(duì)校正因子的影響，必要時(shí)重新確定；第三，要關(guān)注影響待測(cè)物UV吸收的各種因素，如溶液制備所用溶劑最好與最終確定的流動(dòng)相相同，檢測(cè)波長(zhǎng)最好在特定雜質(zhì)及主成分UV曲線的峰或谷處，避開吸收值急劇變化波段，以保證測(cè)定方法具有較好的耐用性，并保持測(cè)定結(jié)果的恒定。 2.2 一般情況下，校正因子可視具體情況通過(guò)如下幾種方法確定： （1）單濃度點(diǎn)測(cè)定：制備適當(dāng)濃度的特定雜質(zhì)對(duì)照品溶液和主成分對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定，照上式計(jì)算，得到校正因子。 （2）多濃度點(diǎn)測(cè)定：制備適當(dāng)?shù)母摺⒅�、低三水平濃度的特定雜質(zhì)對(duì)照品溶液和主成分對(duì)照品溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣測(cè)定，照上式計(jì)算各校正因子，計(jì)算RSD，求平均值，得到校正因子。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定：精密稱取雜質(zhì)對(duì)照品和主成分對(duì)照品，分別制備系列溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣后，按最小二乘法以進(jìn)樣量對(duì)響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。 （4）吸收系數(shù)比值法：對(duì)于UV檢測(cè)器來(lái)講，兩物質(zhì)的相對(duì)校正因子實(shí)際上也是兩物質(zhì)以流動(dòng)相為溶劑，在檢測(cè)波長(zhǎng)處的紫外吸收系數(shù)E1cm1%之比，故可按吸收系數(shù)法測(cè)定法的相關(guān)技術(shù)要求測(cè)定各自吸收系數(shù)，如對(duì)照品級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、高中低三水平濃度測(cè)定、吸收度介于0.3～0.8之間、至少5臺(tái)不同型號(hào)的UV分光光度計(jì)、2份供試液同時(shí)平行制備測(cè)定、同臺(tái)儀器2份供試液的平行測(cè)定結(jié)果不超過(guò)±0.5%等。測(cè)定兩物質(zhì)的吸收系數(shù)后，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析確定兩物質(zhì)吸收系數(shù)，計(jì)算比值，求得校正因子。 上述各方法中，（1）和（2）法較為簡(jiǎn)捷，可以快捷地量化特定雜質(zhì)與主成分紫外吸收特征的差異，多用于評(píng)估采用主成分自身對(duì)照法定量雜質(zhì)時(shí)是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法定量雜質(zhì)，需將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值信息轉(zhuǎn)化為校正因子固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，那么校正因子的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵，校正因子的準(zhǔn)確計(jì)算應(yīng)符合更為嚴(yán)格的要求，需要考慮并控制求算校正因子過(guò)程中的各種誤差因素，以及儀器通用性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素，以便使求得的常數(shù)更為準(zhǔn)確并具代表性，此時(shí)采用（3）、（4）法更為適宜，如能考慮到測(cè)定人員、不同試驗(yàn)室因素的影響，會(huì)更加符合常數(shù)求算的基本要求。 3.校正因子的應(yīng)用 根據(jù)雜質(zhì)研究相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，為確保雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，一般情況下，校正因子在0.9～1.1時(shí)可不予校正，直接采用不加校正因子的自身對(duì)照法定量；超出該范圍，如采用主成分自身對(duì)照法的定量方式，須用校正因子進(jìn)行校正，，即“加校正因子的主成分自身對(duì)照法”以保證雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性；如校正因子在0.2～5.0范圍以外時(shí)，表明雜質(zhì)與主成分的UV吸收相差過(guò)大，校正因子的作用會(huì)受到顯著影響，此時(shí)應(yīng)改變檢測(cè)波長(zhǎng)等檢測(cè)條件，使校正因子位于上述范圍內(nèi)，或使用結(jié)構(gòu)或UV吸收與該雜質(zhì)接近的另一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照物質(zhì)（如對(duì)照品易于獲得、標(biāo)準(zhǔn)已采用對(duì)照品外標(biāo)法定量的另一特定雜質(zhì)），重新確立校正因子；如校正因子仍無(wú)法調(diào)節(jié)至適當(dāng)范圍，需考慮采用雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法等適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)方式定量。 校正因子的應(yīng)用同吸收系數(shù)的使用類似，需要具備一定的前提條件，比如相同的檢測(cè)波長(zhǎng)、分析方法、色譜條件等。需要注意的是，雜質(zhì)的保留時(shí)間差別較大時(shí)，峰形及峰面積會(huì)有較大差別，對(duì)校正因子的校準(zhǔn)作用也會(huì)產(chǎn)生明顯影響，因此色譜峰的保留時(shí)間要相對(duì)恒定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要對(duì)相關(guān)特定雜質(zhì)的色譜峰規(guī)定相對(duì)保留時(shí)間的限定。 在目前的申報(bào)資料中，校正因子的研究和使用中存在一些需要關(guān)注的問(wèn)題。主要表現(xiàn)在如下幾個(gè)方面： （1）特定雜質(zhì)直接采用主成分自身對(duì)照法定量，沒(méi)有進(jìn)行校正因子的研究以及測(cè)定結(jié)果校正前后的數(shù)據(jù)對(duì)比，無(wú)法判斷定量方式的合理性和測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （2）測(cè)定的校正因子超過(guò)指導(dǎo)原則中不需校正的范圍，仍直接采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法。如某藥物中雜質(zhì)I、II、III校正因子分別為2.02、1.47、1.70，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍采用不加校正因子的主成分自身對(duì)照法測(cè)定包括上述三個(gè)雜質(zhì)的各種雜質(zhì)。 （3）測(cè)得的校正因子不能有效校正測(cè)定結(jié)果，在沒(méi)有充分的數(shù)據(jù)支持的情況下，仍采用加校正因子的主成分自身對(duì)照法。如某青蒿素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中去氫青蒿素的定量使用相對(duì)于主成分的校正因子為0.019，該數(shù)值校正能否準(zhǔn)確定量雜質(zhì)，沒(méi)有相應(yīng)研究工作的論證和對(duì)比檢測(cè)數(shù)據(jù)的支持顯然是不夠的。 4.幾點(diǎn)思考與建議 綜上可見(jiàn)，對(duì)于特定雜質(zhì)的控制，校正因子的研究和測(cè)定是非常必要的。評(píng)估雜質(zhì)定量是否需要采用校正因子校正，校正因子能否起到有效的校準(zhǔn)作用，首先要測(cè)定出校正因子，按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則的要求評(píng)估是否需要校正，并提供相應(yīng)的對(duì)比研究資料。這些研究數(shù)據(jù)應(yīng)包括雜質(zhì)對(duì)照品外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對(duì)照法、不加校正因子的主成分自身對(duì)照法對(duì)相同多批樣品雜質(zhì)定量測(cè)定結(jié)果的對(duì)比數(shù)據(jù)，作為是否需要校正或能否有效校正檢測(cè)結(jié)果的支持與依據(jù)。 考慮到校正因子對(duì)雜質(zhì)定量的長(zhǎng)期影響，目前階段校正因子測(cè)定的技術(shù)要求、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求、測(cè)定方法和數(shù)據(jù)處理的要求等尚未十分明確、尚不統(tǒng)一普及，如校正因子需要載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，由省所進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定或進(jìn)行針對(duì)性技術(shù)復(fù)核具有一定必要性。 以上所述僅為個(gè)人觀點(diǎn)，不妥之處期望討論交流。 參考文獻(xiàn) 1、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局 化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則。2005 2、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3A (R).2002 3、BP2011：British Pharmacopoeia Volume V-Appendices-Appendix III Chromatographic Separation Techniques 4、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3B (R).2003 5、張哲峰 我國(guó)藥物研發(fā)中雜質(zhì)研究面臨的挑戰(zhàn)與思考。藥品評(píng)價(jià)，2010，18（7）：12-19 6、張哲峰 化學(xué)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定中若干問(wèn)題探討。藥品技術(shù)審評(píng)論壇-第二屆藥品技術(shù)審評(píng)研討會(huì)論文集 729 7、張哲峰 淺談“色譜方法驗(yàn)證原則”。藥品技術(shù)審評(píng)論壇-第二屆藥品技術(shù)審評(píng)研討會(huì)論文集 739 |
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