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HPLC法校正因子研究中的幾個問題 （引自CDE網(wǎng)站） 已有3人參與
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發(fā)布日期 20111207 欄目 化藥藥物評價>>化藥質(zhì)量控制 標(biāo)題 HPLC法校正因子研究中的幾個問題 作者 張哲峰 部門 化藥藥學(xué)二部 正文內(nèi)容 HPLC法具有將不同物質(zhì)分離后逐一定量的分離分析能力，在藥品有關(guān)物質(zhì)檢測中發(fā)揮著越來越重要的作用，成為藥品雜質(zhì)控制中常用而有效的手段之一。在雜質(zhì)對照品法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法、峰面積歸一化法等幾種常用的雜質(zhì)定量方式中，校正因子的研究對于選擇合適定量方式，準(zhǔn)確定量雜質(zhì)具有重要意義，因而成為雜質(zhì)分析方法研究中的重要內(nèi)容之一。但從目前注冊申報資料實(shí)際情況來看，校正因子的研究和使用中尚存在一些需要進(jìn)一步思考和關(guān)注的問題。 1.校正因子的定義及特點(diǎn) 一般來講，HPLC定量測定中，物質(zhì)的檢測量W與色譜響應(yīng)值（峰面積等）A之間的比值稱為絕對校正因子，即單位響應(yīng)值（峰面積等）所對應(yīng)的被測物質(zhì)的量（濃度或質(zhì)量）；而某物質(zhì)i與所選定的參照物質(zhì)s的絕對校正因子之比，即為相對校正因子，即通常所講的校正因子。 目前校正因子主要用于“加校正因子的主成分自身對照法”定量相關(guān)特定雜質(zhì)，這種定量方式因考慮了雜質(zhì)與主成分的絕對校正因子的不同所引起的測定誤差，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的賦值信息轉(zhuǎn)化為常數(shù)，固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，且不需長期提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因而成為現(xiàn)階段雜質(zhì)控制較為理想可行的手段。但這種方法有時會因不同儀器及色譜條件的波動，可產(chǎn)生一定范圍的誤差，需進(jìn)行充分的方法耐用性驗(yàn)證，并結(jié)合色譜峰定位控制等措施，將誤差控制在一定范圍內(nèi)。 2.校正因子的測定 在校正因子的研究和使用中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、色譜條件、溶劑、檢測波長等均是重要的影響因素，研究中需要予以關(guān)注。 2.1 校正因子的測定需要用到特定雜質(zhì)及主成分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)具備量值準(zhǔn)確的特點(diǎn)，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（對照品）的相關(guān)要求；其次，確定校正因子的分析方法應(yīng)與最終確定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法一致，色譜條件等需經(jīng)篩選優(yōu)化后確定，如有變更，需考慮對校正因子的影響，必要時重新確定；第三，要關(guān)注影響待測物UV吸收的各種因素，如溶液制備所用溶劑最好與最終確定的流動相相同，檢測波長最好在特定雜質(zhì)及主成分UV曲線的峰或谷處，避開吸收值急劇變化波段，以保證測定方法具有較好的耐用性，并保持測定結(jié)果的恒定。 2.2 一般情況下，校正因子可視具體情況通過如下幾種方法確定： （1）單濃度點(diǎn)測定：制備適當(dāng)濃度的特定雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液，分別進(jìn)樣測定，照上式計算，得到校正因子。 （2）多濃度點(diǎn)測定：制備適當(dāng)?shù)母摺⒅�、低三水平濃度的特定雜質(zhì)對照品溶液和主成分對照品溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣測定，照上式計算各校正因子，計算RSD，求平均值，得到校正因子。 （3）標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定：精密稱取雜質(zhì)對照品和主成分對照品，分別制備系列溶液（涵蓋定量限、標(biāo)準(zhǔn)限度），分別進(jìn)樣后，按最小二乘法以進(jìn)樣量對響應(yīng)值（峰面積等）進(jìn)行線性回歸，求得兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，兩曲線斜率之比即為校正因子。 （4）吸收系數(shù)比值法：對于UV檢測器來講，兩物質(zhì)的相對校正因子實(shí)際上也是兩物質(zhì)以流動相為溶劑，在檢測波長處的紫外吸收系數(shù)E1cm1%之比，故可按吸收系數(shù)法測定法的相關(guān)技術(shù)要求測定各自吸收系數(shù)，如對照品級別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、高中低三水平濃度測定、吸收度介于0.3～0.8之間、至少5臺不同型號的UV分光光度計、2份供試液同時平行制備測定、同臺儀器2份供試液的平行測定結(jié)果不超過±0.5%等。測定兩物質(zhì)的吸收系數(shù)后，經(jīng)統(tǒng)計分析確定兩物質(zhì)吸收系數(shù)，計算比值，求得校正因子。 上述各方法中，（1）和（2）法較為簡捷，可以快捷地量化特定雜質(zhì)與主成分紫外吸收特征的差異，多用于評估采用主成分自身對照法定量雜質(zhì)時是否需要校正。但如采用加校正因子的主成分自身對照法定量雜質(zhì)，需將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)賦值信息轉(zhuǎn)化為校正因子固化在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，那么校正因子的準(zhǔn)確性非常關(guān)鍵，校正因子的準(zhǔn)確計算應(yīng)符合更為嚴(yán)格的要求，需要考慮并控制求算校正因子過程中的各種誤差因素，以及儀器通用性和色譜系統(tǒng)的耐用性等因素，以便使求得的常數(shù)更為準(zhǔn)確并具代表性，此時采用（3）、（4）法更為適宜，如能考慮到測定人員、不同試驗(yàn)室因素的影響，會更加符合常數(shù)求算的基本要求。 3.校正因子的應(yīng)用 根據(jù)雜質(zhì)研究相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則，為確保雜質(zhì)測定結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，一般情況下，校正因子在0.9～1.1時可不予校正，直接采用不加校正因子的自身對照法定量；超出該范圍，如采用主成分自身對照法的定量方式，須用校正因子進(jìn)行校正，，即“加校正因子的主成分自身對照法”以保證雜質(zhì)定量的準(zhǔn)確性；如校正因子在0.2～5.0范圍以外時，表明雜質(zhì)與主成分的UV吸收相差過大，校正因子的作用會受到顯著影響，此時應(yīng)改變檢測波長等檢測條件，使校正因子位于上述范圍內(nèi)，或使用結(jié)構(gòu)或UV吸收與該雜質(zhì)接近的另一標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為參照物質(zhì)（如對照品易于獲得、標(biāo)準(zhǔn)已采用對照品外標(biāo)法定量的另一特定雜質(zhì)），重新確立校正因子；如校正因子仍無法調(diào)節(jié)至適當(dāng)范圍，需考慮采用雜質(zhì)對照品外標(biāo)法等適當(dāng)?shù)碾s質(zhì)方式定量。 校正因子的應(yīng)用同吸收系數(shù)的使用類似，需要具備一定的前提條件，比如相同的檢測波長、分析方法、色譜條件等。需要注意的是，雜質(zhì)的保留時間差別較大時，峰形及峰面積會有較大差別，對校正因子的校準(zhǔn)作用也會產(chǎn)生明顯影響，因此色譜峰的保留時間要相對恒定，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需要對相關(guān)特定雜質(zhì)的色譜峰規(guī)定相對保留時間的限定。 在目前的申報資料中，校正因子的研究和使用中存在一些需要關(guān)注的問題。主要表現(xiàn)在如下幾個方面： （1）特定雜質(zhì)直接采用主成分自身對照法定量，沒有進(jìn)行校正因子的研究以及測定結(jié)果校正前后的數(shù)據(jù)對比，無法判斷定量方式的合理性和測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。 （2）測定的校正因子超過指導(dǎo)原則中不需校正的范圍，仍直接采用不加校正因子的主成分自身對照法。如某藥物中雜質(zhì)I、II、III校正因子分別為2.02、1.47、1.70，但質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍采用不加校正因子的主成分自身對照法測定包括上述三個雜質(zhì)的各種雜質(zhì)。 （3）測得的校正因子不能有效校正測定結(jié)果，在沒有充分的數(shù)據(jù)支持的情況下，仍采用加校正因子的主成分自身對照法。如某青蒿素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中去氫青蒿素的定量使用相對于主成分的校正因子為0.019，該數(shù)值校正能否準(zhǔn)確定量雜質(zhì)，沒有相應(yīng)研究工作的論證和對比檢測數(shù)據(jù)的支持顯然是不夠的。 4.幾點(diǎn)思考與建議 綜上可見，對于特定雜質(zhì)的控制，校正因子的研究和測定是非常必要的。評估雜質(zhì)定量是否需要采用校正因子校正，校正因子能否起到有效的校準(zhǔn)作用，首先要測定出校正因子，按照相關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則的要求評估是否需要校正，并提供相應(yīng)的對比研究資料。這些研究數(shù)據(jù)應(yīng)包括雜質(zhì)對照品外標(biāo)法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法對相同多批樣品雜質(zhì)定量測定結(jié)果的對比數(shù)據(jù)，作為是否需要校正或能否有效校正檢測結(jié)果的支持與依據(jù)。 考慮到校正因子對雜質(zhì)定量的長期影響，目前階段校正因子測定的技術(shù)要求、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)要求、測定方法和數(shù)據(jù)處理的要求等尚未十分明確、尚不統(tǒng)一普及，如校正因子需要載入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，由省所進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定或進(jìn)行針對性技術(shù)復(fù)核具有一定必要性。 以上所述僅為個人觀點(diǎn)，不妥之處期望討論交流。 參考文獻(xiàn) 1、國家食品藥品監(jiān)督管理局 化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則。2005 2、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3A (R).2002 3、BP2011：British Pharmacopoeia Volume V-Appendices-Appendix III Chromatographic Separation Techniques 4、ICH Harmonized Tripartite Guideline：Impurities in New drug substances,Q3B (R).2003 5、張哲峰 我國藥物研發(fā)中雜質(zhì)研究面臨的挑戰(zhàn)與思考。藥品評價，2010，18（7）：12-19 6、張哲峰 化學(xué)藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定中若干問題探討。藥品技術(shù)審評論壇-第二屆藥品技術(shù)審評研討會論文集 729 7、張哲峰 淺談“色譜方法驗(yàn)證原則”。藥品技術(shù)審評論壇-第二屆藥品技術(shù)審評研討會論文集 739 |
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