 |
 |
 |
| 24小時(shí)熱門(mén)版塊排行榜 |
- >論壇更新日志 (6101)
- >考研 (2955)
- >導(dǎo)師招生 (2462)
- >蟲(chóng)友互識(shí) (408)
- >文獻(xiàn)求助 (387)
- >碩博家園 (205)
- >休閑灌水 (180)
- >招聘信息布告欄 (114)
- >考博 (108)
- >基金申請(qǐng) (92)
- >博后之家 (75)
- >論文投稿 (52)
- >綠色求助(高懸賞) (51)
- >材料綜合 (25)
- >外文書(shū)籍求助 (19)
- >SciFinder/Reaxys (18)
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 5 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 5672 | 回復(fù): 13 | ||||||||
| 本帖產(chǎn)生 2 個(gè) MolEPI ，點(diǎn)擊這里進(jìn)行查看 | ||||||||
| 當(dāng)前只顯示滿足指定條件的回帖，點(diǎn)擊這里查看本話題的所有回帖 | ||||||||
木左左銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
|
[求助]
高GC含量基因片段PCR問(wèn)題
|
|||||||
|
大家好，我現(xiàn)在克隆一組目的片段，以cDNA為模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超過(guò)60%，實(shí)驗(yàn)做了2個(gè)多月，沒(méi)有進(jìn)展，很是苦惱 主要用的大連寶生物的la酶和GCbuffer 我在網(wǎng)上搜過(guò)，高GC含量片段國(guó)內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國(guó)外更多的是專(zhuān)利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問(wèn)題： 1.關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題，需要特別注意什么？ 2.反應(yīng)體系的問(wèn)題，個(gè)組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ 3.程序問(wèn)題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ 4.比較高的GC含量到底對(duì)基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ 如果哪位師兄師姐有這方面的經(jīng)驗(yàn)或者是專(zhuān)利方面的信息業(yè)希望可以告訴我，小弟不勝感激，謝謝大家！ |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專(zhuān)輯推薦
 PCR技術(shù) | 生物信息學(xué)軟件應(yīng)用 | 【分子生物】EPI帖 | 有助于于我的SNP |
| 生物資源 | 基因工程和分子生物學(xué) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有159人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
湖北師范大學(xué)招調(diào)劑啦
已經(jīng)有6人回復(fù)
-
邵陽(yáng)學(xué)院食品與化學(xué)工程學(xué)院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
天津商業(yè)大學(xué) 生物與醫(yī)藥課題組招生
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
生物化工學(xué)碩招收調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- 大片段PCR擴(kuò)增求助
已經(jīng)有34人回復(fù)
- 關(guān)于GC含量高的模板
已經(jīng)有12人回復(fù)
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 基因組中長(zhǎng)片段PCR應(yīng)該注意的幾個(gè)問(wèn)題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- PCR ， 雙酶切，連接問(wèn)題
已經(jīng)有17人回復(fù)
- pcr，RACE,低表達(dá)量基因的克隆
已經(jīng)有8人回復(fù)
- PCR 擴(kuò)全長(zhǎng)
已經(jīng)有20人回復(fù)
- 【求助/交流】菌落PCR求助
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 【求助/交流】基因組PCR老P不出目的帶
已經(jīng)有39人回復(fù)
blackrose8089
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 16
- 應(yīng)助: 100 (初中生)
- 貴賓: 0.11
- 金幣: 10639.6
- 散金: 155
- 紅花: 30
- 沙發(fā): 6
- 帖子: 3703
- 在線: 790.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 614948
- 注冊(cè): 2008-09-28
- 專(zhuān)業(yè): 植物學(xué)研究的新技術(shù)、新方
8樓2011-12-09 21:35:40
brightfuture01
木蟲(chóng)之王 (文壇精英)
我愛(ài)打老虎
- MolEPI: 14
- 應(yīng)助: 24 (小學(xué)生)
- 貴賓: 1.2
- 金幣: 113310
- 散金: 1526
- 紅花: 224
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 28948
- 在線: 3691.8小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 464575
- 注冊(cè): 2007-11-21
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 神經(jīng)生物學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
|
1，如果是為了表達(dá)的話，引物設(shè)計(jì)時(shí)候可以將一部分GC變成其他堿基（在編碼的氨基酸不變的情況下）,，這樣可以使得引物的退火溫度降低。 2，我當(dāng)初做GC的時(shí)候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果還不錯(cuò)，70%+的GC，有兩種GC buffer A 和B，如果A不行的話試試B。 3，Tm高的話，退火溫度可以適當(dāng)設(shè)置高一些。變性也可以比95度高那么幾度。 4， 這個(gè)問(wèn)題我回答不了。 我的一點(diǎn)建議： 如果PCR產(chǎn)物很弱的話，可以做個(gè)膠回收，連T，然后讓其在質(zhì)粒里面復(fù)制從而獲得大量的目的基因片段。 PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以試著加點(diǎn)DMSO、NaOH、甘油等東西試試。60%應(yīng)該不是很難擴(kuò)增的。 |
2樓2011-12-08 23:32:53
木左左
銀蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
- 應(yīng)助: 2 (幼兒園)
- 金幣: 436.7
- 散金: 70
- 帖子: 324
- 在線: 103.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1020700
- 注冊(cè): 2010-05-17
- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
3樓2011-12-09 17:04:27
luckyhongli
金蟲(chóng) (小有名氣)
- MolEPI: 1
- 應(yīng)助: 14 (小學(xué)生)
- 金幣: 1164.9
- 散金: 132
- 紅花: 6
- 帖子: 292
- 在線: 62.4小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1530774
- 注冊(cè): 2011-12-09
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
【答案】應(yīng)助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請(qǐng)教 2011-12-09 21:40:41
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請(qǐng)教 2011-12-09 21:40:41
|
這個(gè)問(wèn)題我在國(guó)外的時(shí)候也碰到過(guò)，當(dāng)時(shí)我擴(kuò)增一個(gè)基因的promoter區(qū)，GC含量70%以上，后來(lái)解決了： 方法1. 巢式PCR，在目的片段的兩端非高GC含量區(qū)設(shè)計(jì)引物，比如可以擴(kuò)增2500到3000 bp，然后以此為模板進(jìn)行第二次PCR。 方法2. 換酶，我用過(guò)ABI的gold 360，附帶GC buffer，效果非常不錯(cuò)。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。 你的問(wèn)題答復(fù)如下： 我在網(wǎng)上搜過(guò)，高GC含量片段國(guó)內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國(guó)外更多的是專(zhuān)利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問(wèn)題： 1.關(guān)于引物設(shè)計(jì)的問(wèn)題，需要特別注意什么？ > 我用Primer3Plus設(shè)計(jì)引物，效果非常好。引物設(shè)計(jì)的注意事項(xiàng)較多，在這里關(guān)鍵不要在3‘末端有連續(xù)的G或C。 2.反應(yīng)體系的問(wèn)題，個(gè)組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ > ABI的金牌360，額外的GC buffer。 3.程序問(wèn)題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ > 退火溫度最高在63或65度，再高也沒(méi)有好處。 根據(jù)酶的不同，變性溫度可以在95度5到10分鐘。 4.比較高的GC含量到底對(duì)基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ > 一般啟動(dòng)子區(qū)域或遺傳印記區(qū)域GC含量較高， 本人博士畢業(yè)后在國(guó)外做博士后幾年，目前在上海一著名大學(xué)任教授，具有多年的分子生物學(xué)經(jīng)驗(yàn) |
4樓2011-12-09 17:45:42
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +3 | 珂珂樂(lè) 2026-04-02 | 3/150 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 310求調(diào)劑 +17 | 爭(zhēng)取九點(diǎn)睡 2026-03-30 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑，計(jì)算材料方向 +10 | 吸喵有害笙命 2026-04-01 | 11/550 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +6 | 懶羊羊輕置玉臀 2026-04-02 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 一志愿同濟(jì)大學(xué)323分（080500）求調(diào)劑 +6 | yikeniu 2026-04-01 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 314求調(diào)劑 +11 | 1xiaojun23 2026-03-31 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 08開(kāi)頭看過(guò)來(lái)�。�！ +4 | wwwwffffff 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 270調(diào)劑 +7 | maxjxbsk 2026-04-02 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 08生物與醫(yī)藥專(zhuān)碩初試346找調(diào)劑 +6 | dianeeee 2026-04-01 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿南京師范大學(xué)計(jì)算機(jī)專(zhuān)碩，初試373，六級(jí)通過(guò)， +3 | 計(jì)算機(jī)追夢(mèng)人 2026-04-01 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +8 | 呢呢妮妮 2026-04-01 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 310分求調(diào)劑 +4 | 成功上岸wang 2026-04-01 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 0703求調(diào)劑 +4 | zizimo 2026-03-31 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +4 | 圖鑒212 2026-03-30 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 一志愿 南京航空航天大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +7 | @taotao 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 311求調(diào)劑一志愿合肥工業(yè)大學(xué) +14 | 秋二十二 2026-03-30 | 14/700 |
|
|
|
[考研] 086000生物與醫(yī)藥298調(diào)劑求助 +4 | 元元青青 2026-03-31 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 哈爾濱工業(yè)大學(xué)材料與化工專(zhuān)碩378求調(diào)劑 +3 | 塔比烏斯 2026-03-30 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +7 | DLkz1314. 2026-03-30 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿南京航空航天大學(xué)材料學(xué)碩求調(diào)劑 +3 | @taotao 2026-03-28 | 3/150 |
|