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木左左銀蟲 (正式寫手)
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[求助]
高GC含量基因片段PCR問題
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大家好，我現(xiàn)在克隆一組目的片段，以cDNA為模板，片段大小2kbp左右，GC含量均超過60%，實驗做了2個多月，沒有進展，很是苦惱 主要用的大連寶生物的la酶和GCbuffer 我在網(wǎng)上搜過，高GC含量片段國內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國外更多的是專利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問題： 1.關(guān)于引物設(shè)計的問題，需要特別注意什么？ 2.反應(yīng)體系的問題，個組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ 3.程序問題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ 4.比較高的GC含量到底對基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ 如果哪位師兄師姐有這方面的經(jīng)驗或者是專利方面的信息業(yè)希望可以告訴我，小弟不勝感激，謝謝大家！ |
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木左左
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9樓2011-12-09 21:50:47
brightfuture01
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【答案】應(yīng)助回帖
1949stone(MolEPI+1): 很好 2011-12-09 00:57:55
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
木左左(金幣+5): 非常感謝 2011-12-09 17:01:21
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1，如果是為了表達的話，引物設(shè)計時候可以將一部分GC變成其他堿基（在編碼的氨基酸不變的情況下）,，這樣可以使得引物的退火溫度降低。 2，我當(dāng)初做GC的時候就是用的TaKaRa的酶和buffer，效果還不錯，70%+的GC，有兩種GC buffer A 和B，如果A不行的話試試B。 3，Tm高的話，退火溫度可以適當(dāng)設(shè)置高一些。變性也可以比95度高那么幾度。 4， 這個問題我回答不了。 我的一點建議： 如果PCR產(chǎn)物很弱的話，可以做個膠回收，連T，然后讓其在質(zhì)粒里面復(fù)制從而獲得大量的目的基因片段。 PCR不一定非要使用公司的GCbuffer，可以試著加點DMSO、NaOH、甘油等東西試試。60%應(yīng)該不是很難擴增的。 |
2樓2011-12-08 23:32:53
木左左
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3樓2011-12-09 17:04:27
luckyhongli
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【答案】應(yīng)助回帖
mengfei8336(MolEPI+1): 2011-12-09 19:15:40
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請教 2011-12-09 21:40:41
木左左(金幣+5): 非常感謝，不知道您能不能告知聯(lián)系方式，我好繼續(xù)向您請教 2011-12-09 21:40:41
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這個問題我在國外的時候也碰到過，當(dāng)時我擴增一個基因的promoter區(qū)，GC含量70%以上，后來解決了： 方法1. 巢式PCR，在目的片段的兩端非高GC含量區(qū)設(shè)計引物，比如可以擴增2500到3000 bp，然后以此為模板進行第二次PCR。 方法2. 換酶，我用過ABI的gold 360，附帶GC buffer，效果非常不錯。提醒一下，GC buffer的用量要摸索。 你的問題答復(fù)如下： 我在網(wǎng)上搜過，高GC含量片段國內(nèi)肯定很多學(xué)校有成熟的方法，國外更多的是專利，我希望大家能幫幫我，他別是一下問題： 1.關(guān)于引物設(shè)計的問題，需要特別注意什么？ > 我用Primer3Plus設(shè)計引物，效果非常好。引物設(shè)計的注意事項較多，在這里關(guān)鍵不要在3‘末端有連續(xù)的G或C。 2.反應(yīng)體系的問題，個組分的量，哪種酶效果好，額外的試劑？ > ABI的金牌360，額外的GC buffer。 3.程序問題，Tm值較高，是不是退火溫度也可以比較高？變形溫度用不用很高？ > 退火溫度最高在63或65度，再高也沒有好處。 根據(jù)酶的不同，變性溫度可以在95度5到10分鐘。 4.比較高的GC含量到底對基因的結(jié)構(gòu)有什么影響？ > 一般啟動子區(qū)域或遺傳印記區(qū)域GC含量較高， 本人博士畢業(yè)后在國外做博士后幾年，目前在上海一著名大學(xué)任教授，具有多年的分子生物學(xué)經(jīng)驗 |
4樓2011-12-09 17:45:42
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