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zhiqiang5070木蟲 (正式寫手)
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[求助]
[size=5]外源基因原核表達(dá)遭遇種種瓶頸，求各位高手近來解答[/size]
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我做的是交替氧化酶在大腸桿菌里的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過action引物驗(yàn)證沒問題，通過特異引物PCR，回收純化，連接到T載體，成功轉(zhuǎn)化。菌液送測，無問題。提質(zhì)粒，酶切，回收純化，連接到酶切純化后的ｐET28a上。然后轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21中。送測，沒問題，用IPTG誘導(dǎo)，可是又到不出來，SDS-PAGE老是無目的帶。 后面又重提T載體質(zhì)粒開始做，可是做了2次都沒有轉(zhuǎn)化BL21成功。對連接產(chǎn)物做凝膠成像符合預(yù)期。 這是腫么了？哪里出問題了？ 打算重頭開始做，又找不到問題所在，害怕徒勞無功啊。大家?guī)兔μ峤ㄗh啦，謝謝。。。。本人小蟲，金幣不多，還望見諒。 PS：我的目的片段5‘端有兩個(gè)ATG，內(nèi)切酶SacI 和XhoI ，兩者相距２１ｂｐ。 |
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zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:05
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zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:05
| IPTG誘導(dǎo)不出來目標(biāo)蛋白很有可能是質(zhì)粒載體構(gòu)建出了問題，不知道你IPTG加入量多少，但個(gè)人覺得IPTG誘導(dǎo)能力超強(qiáng)，只要加進(jìn)去就會誘導(dǎo)出蛋白，SDS-PAGE上就會有條帶。建議你從上游查起。祝好運(yùn) |
7樓2012-02-08 14:51:52
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木(金幣+3): 同勉，我也有這個(gè)經(jīng)歷。呵呵 2012-02-09 13:45:47
zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:34
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木(金幣+3): 同勉，我也有這個(gè)經(jīng)歷。呵呵 2012-02-09 13:45:47
zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:34
這種問題我曾經(jīng)遇到過，反復(fù)構(gòu)建了兩次表達(dá)載體，均沒有表達(dá)出來。經(jīng)過核實(shí)，認(rèn)為問題出在基因的密碼子使用偏好上，后來我們按照大腸菌的密碼使用偏好設(shè)計(jì)了基因，全人工合成了該基因，結(jié)果就表達(dá)出來了。希望我的經(jīng)歷能給你幫助。 |
8樓2012-02-09 10:55:08
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10樓2012-02-10 09:47:16
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