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zhiqiang5070木蟲 (正式寫手)
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[求助]
[size=5]外源基因原核表達(dá)遭遇種種瓶頸，求各位高手近來(lái)解答[/size]
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我做的是交替氧化酶在大腸桿菌里的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，通過(guò)action引物驗(yàn)證沒問(wèn)題，通過(guò)特異引物PCR，回收純化，連接到T載體，成功轉(zhuǎn)化。菌液送測(cè)，無(wú)問(wèn)題。提質(zhì)粒，酶切，回收純化，連接到酶切純化后的ｐET28a上。然后轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21中。送測(cè)，沒問(wèn)題，用IPTG誘導(dǎo)，可是又到不出來(lái)，SDS-PAGE老是無(wú)目的帶。 后面又重提T載體質(zhì)粒開始做，可是做了2次都沒有轉(zhuǎn)化BL21成功。對(duì)連接產(chǎn)物做凝膠成像符合預(yù)期。 這是腫么了？哪里出問(wèn)題了？ 打算重頭開始做，又找不到問(wèn)題所在，害怕徒勞無(wú)功啊。大家?guī)兔μ峤ㄗh啦，謝謝。。。。本人小蟲，金幣不多，還望見諒。 PS：我的目的片段5‘端有兩個(gè)ATG，內(nèi)切酶SacI 和XhoI ，兩者相距２１ｂｐ。 |
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zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:05
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zhiqiang5070(金幣+1): ★有幫助 2012-02-20 15:27:05
| IPTG誘導(dǎo)不出來(lái)目標(biāo)蛋白很有可能是質(zhì)粒載體構(gòu)建出了問(wèn)題，不知道你IPTG加入量多少，但個(gè)人覺得IPTG誘導(dǎo)能力超強(qiáng)，只要加進(jìn)去就會(huì)誘導(dǎo)出蛋白，SDS-PAGE上就會(huì)有條帶。建議你從上游查起。祝好運(yùn) |
7樓2012-02-08 14:51:52
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2樓2012-02-07 11:30:20
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3樓2012-02-07 12:54:25
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4樓2012-02-07 14:20:04
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