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點突變pcr后跑瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現條帶不對，請高手指點�。�！
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本人想把一個質粒（7.8kbp）中的一個氨基酸變成另一個氨基酸，因此有連續(xù)三個點要突變。 選擇使用的方法是合成兩個反向互補的包含突變位點的引物，GC%=60% Tm=86.8如下： F： CACAGTCTGGGGCATCGATCAGCTCCAGGCAAGAG R：CTCTTGCCTGGAGCTGATCGATGCCCCAGACTGTG 用Fermentas的Premix PrimeSTAR 進行PCR 98℃ 1min 1cycle；98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃ 8min 24cycle；72℃ 10min 1cycle PCR后進行電泳 第一泳道為maker 第二泳道為不加引物做的PCR 最后一個泳道為模板質粒 中間的都是不同濃度的模板和引物做的PCR產物 可見PCR產物最亮的條帶與模板質粒位置相差很大  將PCR產物用DpnI酶切后 模板切掉；再進行轉化，發(fā)現LB平板上有兩種克隆，一種是很大很亮的單克隆，但在它們旁邊還有許多星星點點的小克隆 求助！求高手！請問這是怎么回事？ 出現什么問題了嗎？ 之前實驗室有人用相同方法做不同的質粒是可以成功的 |
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數 +1
| 你好，我也是做突變的，用的酶也是prime STAR酶，你跑膠的質粒是超螺旋的，而pcr產物是線性的，這個不好對照。按照這個酶推薦的程序，我會這樣設計：98℃ 3min 1cycle；98℃ 10sec， 60-68℃10sec，72℃ 8min 30cycles；72℃ 10min 1cycle，引物設計的話你們實驗室也做了估計不會錯的，有經驗了嘛，針對這個“將PCR產物用DpnI酶切后 模板切掉；再進行轉化，發(fā)現LB平板上有兩種克隆，一種是很大很亮的單克隆，但在它們旁邊還有許多星星點點的小克隆”，首先消化一定要完全，不然原始質粒會影響實驗結果，還有就是轉化后培養(yǎng)時間是不是超過16小時，這樣會長出衛(wèi)星菌落。如果長出來的菌很大很大喝以前轉化不同的話估計就是感受態(tài)染菌了。 |
2樓2012-02-18 21:20:06
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