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點(diǎn)突變pcr后跑瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)條帶不對(duì)，請(qǐng)高手指點(diǎn)�。。�
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本人想把一個(gè)質(zhì)粒（7.8kbp）中的一個(gè)氨基酸變成另一個(gè)氨基酸，因此有連續(xù)三個(gè)點(diǎn)要突變。 選擇使用的方法是合成兩個(gè)反向互補(bǔ)的包含突變位點(diǎn)的引物，GC%=60% Tm=86.8如下： F： CACAGTCTGGGGCATCGATCAGCTCCAGGCAAGAG R：CTCTTGCCTGGAGCTGATCGATGCCCCAGACTGTG 用Fermentas的Premix PrimeSTAR 進(jìn)行PCR 98℃ 1min 1cycle；98℃ 10sec， 55℃ 5sec，72℃ 8min 24cycle；72℃ 10min 1cycle PCR后進(jìn)行電泳 第一泳道為maker 第二泳道為不加引物做的PCR 最后一個(gè)泳道為模板質(zhì)粒 中間的都是不同濃度的模板和引物做的PCR產(chǎn)物 可見(jiàn)PCR產(chǎn)物最亮的條帶與模板質(zhì)粒位置相差很大  將PCR產(chǎn)物用DpnI酶切后 模板切掉；再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)LB平板上有兩種克隆，一種是很大很亮的單克隆，但在它們旁邊還有許多星星點(diǎn)點(diǎn)的小克隆 求助！求高手！請(qǐng)問(wèn)這是怎么回事？ 出現(xiàn)什么問(wèn)題了嗎？ 之前實(shí)驗(yàn)室有人用相同方法做不同的質(zhì)粒是可以成功的 |
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todouhy
銅蟲(chóng) (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 你好，我也是做突變的，用的酶也是prime STAR酶，你跑膠的質(zhì)粒是超螺旋的，而pcr產(chǎn)物是線性的，這個(gè)不好對(duì)照。按照這個(gè)酶推薦的程序，我會(huì)這樣設(shè)計(jì)：98℃ 3min 1cycle；98℃ 10sec， 60-68℃10sec，72℃ 8min 30cycles；72℃ 10min 1cycle，引物設(shè)計(jì)的話你們實(shí)驗(yàn)室也做了估計(jì)不會(huì)錯(cuò)的，有經(jīng)驗(yàn)了嘛，針對(duì)這個(gè)“將PCR產(chǎn)物用DpnI酶切后 模板切掉；再進(jìn)行轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)LB平板上有兩種克隆，一種是很大很亮的單克隆，但在它們旁邊還有許多星星點(diǎn)點(diǎn)的小克隆”，首先消化一定要完全，不然原始質(zhì)粒會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還有就是轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)時(shí)間是不是超過(guò)16小時(shí)，這樣會(huì)長(zhǎng)出衛(wèi)星菌落。如果長(zhǎng)出來(lái)的菌很大很大喝以前轉(zhuǎn)化不同的話估計(jì)就是感受態(tài)染菌了。 |
2樓2012-02-18 21:20:06
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