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[交流] 求基因敲除高手。。。。

我基因敲除用的方法是同源重組，設(shè)計(jì)的上游同源臂測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)有個(gè)別位點(diǎn)突變，請(qǐng)問(wèn)影響基因敲除實(shí)驗(yàn)嗎？會(huì)不會(huì)影響上游基因的表達(dá)？（上游基因的ORF與下游基因的ORF方向相同。）

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1樓 2012-03-31 21:25:40

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lincy2010

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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805085868(金幣+1): 謝謝參與
西瓜: 金幣+3, 回復(fù)很耐心啊~愚人節(jié)快樂(lè)O(∩_∩)O 2012-04-01 17:43:00

首先想問(wèn)你測(cè)序的方式是什么？PCR產(chǎn)物直接測(cè)還是連到載體上再測(cè)？測(cè)的是雙向還是單向？因?yàn)檫@些會(huì)影響測(cè)序結(jié)果的可信度。
其次，“個(gè)別位點(diǎn)突變”指的是只突變一個(gè)嗎？如果同源臂較長(zhǎng)，估計(jì)是不影響重組實(shí)驗(yàn)，但突變的位點(diǎn)會(huì)不會(huì)在重組體中那就不一定了，有機(jī)率在，也有機(jī)率不在�？梢訮CR包含上游同源臂的片斷測(cè)序驗(yàn)證。
再次，如果篩選到的都有這個(gè)突變位點(diǎn)，會(huì)不會(huì)影響基因表達(dá)，要看突變的處于哪個(gè)位置。若在翻譯區(qū)，會(huì)不會(huì)造成移碼突變，若只是換了堿基，看蛋白序列改變了沒(méi)；若在非翻譯區(qū)，還在看是否改了啟動(dòng)子RBS等等，大概就是這樣吧，說(shuō)的不對(duì)的，請(qǐng)大家指正哈~
愚人節(jié)快樂(lè)，不得不說(shuō)小木蟲(chóng)太有才啦^-^

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3樓2012-04-01 01:40:52

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weishengsu5

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

突變不在CDS區(qū)域就不會(huì)有影響吧，除非位于終止序列。。

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5樓2012-04-01 21:54:52

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lwtong8320

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做基因敲除最好還是不要有堿基錯(cuò)誤。如果突變體與野生型相比有變化，有時(shí)不好判斷是不是這個(gè)錯(cuò)誤堿基在里面起作用。

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6樓2012-04-02 12:29:38

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sisy_shaw

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我也遇見(jiàn)了同樣的問(wèn)題，上下游同源臂都有好幾個(gè)堿基的錯(cuò)配，不是到lz大人是怎么辦的呢？求助~~~

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7樓2012-08-13 15:45:51

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FQQ12002A

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你好，我想咨詢(xún)你一下，我想進(jìn)行絲狀真菌的敲除，但是載體沒(méi)有，而且最初用來(lái)連目的基因的也沒(méi)有，比如pSKH載體，怎么辦呢？

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8樓2013-11-06 21:36:18

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沙門(mén)小rna

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是用什么同源重組的方法？自殺質(zhì)粒？λ-red重組系統(tǒng)？同源臂多長(zhǎng)？在什么位置的突變？這些問(wèn)題沒(méi)有的話(huà)。就不能分析了啊。同源臂有幾個(gè)堿基的突變還可能是測(cè)序誤差的。

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9樓2013-11-07 10:18:56

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簡(jiǎn)單回復(fù)

__小朋友_2樓

2012-03-31 22:48 回復(fù)

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Rosy_yidun4樓

2012-04-01 10:16 回復(fù)

小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
西瓜: 金幣-10, 違規(guī)存檔, 廣告 2012-04-01 17:43:19
西瓜: 編輯內(nèi)容 2012-04-01 17:43

-- [ Last edited by 西瓜 on 2012-4-1 at 17:43 ]

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