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laverne銅蟲 (小有名氣)
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[交流]
蛋白突變后不表達(dá)了 已有4人參與
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大家好，我現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)遇到個現(xiàn)象，苦惱ing，煩請大家給予指點(diǎn) 定點(diǎn)突變蛋白之后，在bl21中不表達(dá)了，嘗試各種優(yōu)化，沒有效果，有人能解釋這是什么原因嗎？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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laverne
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2樓2012-04-10 16:44:46
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3樓2012-04-20 16:38:53
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西瓜: 金幣+5, MolEPI+1, 應(yīng)助指數(shù)+1, 果然專業(yè)！ 2012-04-23 18:50:33
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一般來講，先確定新的啟動子存在且有效，其次確定起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)存在且有效，然后有軟件模擬一下mRNA突變后是否構(gòu)成了二級結(jié)構(gòu)，是否有移碼突變，是否構(gòu)成了稀有密碼子，是否提前中斷翻譯，再有考慮突變產(chǎn)物蛋白質(zhì)是否構(gòu)成新的酶切位點(diǎn)和是否在三維結(jié)構(gòu)上發(fā)生了折疊異常（引入突變位點(diǎn)也是研究蛋白質(zhì)折疊的一種常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)）。 還要考慮突變產(chǎn)物蛋白質(zhì)是不是參與形成了原來沒有的超分子結(jié)構(gòu)（聚合體）或者影響了原有的四級結(jié)構(gòu)的形成。 |
4樓2012-04-20 17:13:50
laverne
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謝謝您的意見！ 首先，蛋白突變只發(fā)生在c端（原始的蛋白表達(dá)量還可以），不涉及啟動子以及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的變化。 其次，測序結(jié)果認(rèn)真查看了沒有發(fā)生移碼，也沒有終止密碼子提前形成。 另外，想要跟您請教的是： 我用軟件模擬了mRNA突變后的二級結(jié)構(gòu)，看上去是發(fā)生了挺大的改變。但是我不知道這個模擬結(jié)果該如何分析？您是否可以給些意見？ 從自由能來看，原始的是－229kkal/mol, 突變后是－200kkal/mol ps:由于目標(biāo)蛋白帶有his標(biāo)簽，純化后完全木有東西，所以沒法考慮聚合體形成的問題。 |
5樓2012-04-23 18:48:37
凌波麗
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一般來說，由于真核生物細(xì)胞中的由于存在翻譯起始因子eIF4A,eIF4B在核糖體翻譯時去除mRNA的二級結(jié)構(gòu)，所以只要不是很大的二級結(jié)構(gòu)改變一般不至于影響翻譯過程。你可以檢測一下工程細(xì)胞中翻譯起始因子eIF4A,eIF4B是否都正常表達(dá)，若沒有足量的eIF4A，那么mRNA的二級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)改變可能足以引起表達(dá)障礙，若沒有足量的eIF4B，那么eIF4A足量表達(dá)eIF4A的效率也會很低。 另外，我覺得你該查一下工程細(xì)胞的目的蛋白質(zhì)突變后是不是影響了它與別的蛋白質(zhì)或DNA特異性片段之間的專一性結(jié)合，比如說它原本與某種轉(zhuǎn)錄因子又結(jié)合，但是突變后使該結(jié)合失效。 |
6樓2012-04-23 22:10:03
凌波麗
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8樓2012-09-20 20:26:48
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