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wushuwei1104銀蟲(chóng) (小有名氣)
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[求助]
同源比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PCR產(chǎn)物測(cè)序不符！
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找親緣關(guān)系相近的生物做基因比對(duì)，找出基因保守區(qū)，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，PCR擴(kuò)增得到單一的條帶，拿去測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與之前比對(duì)的保守區(qū)域相似度極低�。《荚O(shè)計(jì)了10多對(duì)簡(jiǎn)并引物，反復(fù)PCR切膠回收測(cè)序，做了半年多了。眼看著即將畢業(yè)卻沒(méi)有什么可用的結(jié)果。急呀-----！ 想請(qǐng)各位大仙幫幫忙，想想辦法。俺看是哪些地方的問(wèn)題�。。≈x謝了�。�！ 師兄說(shuō)之前從沒(méi)有出現(xiàn)過(guò)這種情況，說(shuō)的我心里發(fā)毛，不知該怎么辦了�。。�！ [ Last edited by wushuwei1104 on 2012-4-12 at 13:06 ] |
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xiazhiwuxie
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-04-12 13:51:17
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樓主可以說(shuō)清楚點(diǎn)嗎？你設(shè)計(jì)了10對(duì)引物，每次都擴(kuò)出片段出來(lái)了嗎？還是部分?jǐn)U出來(lái)了，最后拿去測(cè)序不對(duì)？測(cè)序的結(jié)果之間比對(duì)了嗎？ 引物的簡(jiǎn)并度是多少，盡量不要太高，還有RNA的質(zhì)量一定要好。 如果實(shí)驗(yàn)沒(méi)有什么錯(cuò)誤的話，考慮一下基因的豐度問(wèn)題，是不是最好用什么處理一下，誘導(dǎo)一下表達(dá)，再克隆基因？ |
2樓2012-04-12 13:12:52
xiazhiwuxie
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wushuwei1104: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-04-13 13:16:35
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如果是你的條帶的話，菌液應(yīng)該是非常亮的。注意引物的簡(jiǎn)并度不能很高，最好128以內(nèi)吧。你說(shuō)每次擴(kuò)增都有條帶，盡量找退火溫度高的引物的進(jìn)行擴(kuò)增（如果是10條基因的話，可以之間組合一下試試），可以做個(gè)降落式PCR，前幾個(gè)循環(huán)退火溫度高些，然后再慢慢降低。 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，一定要搞清楚，這個(gè)基因在你的材料中有沒(méi)有表達(dá)。如果還是趕著要畢業(yè)的話，還是最好同時(shí)擴(kuò)增其他基因，不要把所有的希望都寄托在一個(gè)基因上面。 |
» 本帖已獲得的紅花（最新10朵）
wushuwei11044樓2012-04-12 21:13:57
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是10對(duì)引物，，每次擴(kuò)增都有條帶，有的是但一條帶且與預(yù)期大小相符，有些是有雜帶，但我每次測(cè)序都是選取和預(yù)期的片段大小相符的去測(cè)序，結(jié)果都不對(duì)。同一引物擴(kuò)增出來(lái)的片段經(jīng)測(cè)序后比對(duì)，幾乎完全相同。不同引物之間比對(duì)，相似度低。 現(xiàn)在師兄也是想到了基因豐度的問(wèn)題，碩士有可能這個(gè)基因還沒(méi)有表達(dá)，或表達(dá)量不太高，所以可能擴(kuò)增出雜帶。但是應(yīng)用NCBI里的BLAST搜索那些測(cè)序的序列，沒(méi)有與之相似的基因報(bào)道。這不是要愁死人了嗎！�。。� |
3樓2012-04-12 20:35:59
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5樓2012-04-13 13:15:39
6樓2012-06-08 23:37:11
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7樓2012-06-09 08:32:22
8樓2012-06-09 16:53:34
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9樓2012-06-09 23:16:49
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請(qǐng)問(wèn)設(shè)計(jì)兼并引物參考NDA序列還是氨基酸序列？因?yàn)槲覍⒖嫉膸讞lDNA序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在對(duì)應(yīng)的保守序列中對(duì)應(yīng)的氨基酸都是同一種密碼子決定的，如果引物中使用這種密碼子，兼并度會(huì)低很多，但如果將一條氨基酸序列輸入primer 5，再翻譯成DNA。這樣在保守區(qū)的設(shè)計(jì)的兼并引物兼并度很高。 我第一次設(shè)計(jì)兼并引物，實(shí)驗(yàn)室也沒(méi)人設(shè)計(jì)過(guò)，只是從網(wǎng)上看到一些教程學(xué)的。這個(gè)問(wèn)題一直困擾著我，還請(qǐng)大俠指教。 |
10樓2012-06-10 15:35:07
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