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3個(gè)片段的重疊pcr能否一步到位？
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有三個(gè)片段，分別為330 150 250bp，兩個(gè)接頭都有20bp的重疊序列，想一次性拼起來(lái)。PCR時(shí)分步進(jìn)行，先是不加引物，單純擴(kuò)模板。希望得到三個(gè)片段正確連接的模板。然后加入第一個(gè)片段的上游引物和第三個(gè)片段的下游引物，做了好幾次了，之前都會(huì)出現(xiàn)250bp的條帶，又一次在目的條帶大小處有點(diǎn)模糊的亮區(qū)，但是比250bp處的條帶暗很多。最后一次什么條帶都沒(méi)了。 拼模板時(shí)的退火溫度試過(guò)55至40℃的梯度，和40到30℃的touchdown，都是10個(gè)循環(huán)，后面加入引物的擴(kuò)增試過(guò)50-68℃的梯度，都沒(méi)有能成功。我自己覺(jué)得問(wèn)題主要處在3片段的模板沒(méi)有連出來(lái)。不知道有沒(méi)有人遇到過(guò)類似的情況？該怎么解決？ 關(guān)于出現(xiàn)250bp的非目的條帶，懷疑是單引物擴(kuò)增，引物第三個(gè)片段剛好也是250bp的樣子。不知道這種情況在不跟換引物的前提下還能不能做下去？ |
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果子么么茶
木蟲 (著名寫手)
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7樓2012-04-16 22:27:58
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