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dfhfzyl鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段PCR(2.1K)擴(kuò)增求助
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我要擴(kuò)增一個片段為2100bp的cDNA 我的目的基因是來自柑橘的基因,柑橘基因組已經(jīng)發(fā)布了. 設(shè)計引物時,直接選基因cds全長的頭尾14-22bp, 正反引物的GC比例盡量保持一致了. 我的擴(kuò)增條件是: 模板2ul (模板濃度約為500ng) 正反引物為0.2ul buffer 2ul dNTP 2ul Mgcl2 1.2ul Taq酶 0.2 (我?guī)熜纸ㄗh我在真正擴(kuò)增時需選擇高保真酶如pfu) ddH2O2調(diào)到20ul體系 PCR條件 94度4min 94度30秒 55度30秒 72度2:10分 30個循環(huán) 72度10分 4度半小時 按照以上的程序,我對6個目的基因(大小在都在2kB左右)擴(kuò)增了好幾次都沒有明顯的帶出來或者帶很弱,而有一個基因出現(xiàn)了三條非常弱的帶? 求助高手!!! |
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1949stone: MolEPI+1 2012-05-03 07:27:34
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1.這么大的cDNA確實不好擴(kuò)，樓主首先要保證模板的質(zhì)量，這是先決條件。 2.如果模板沒問題可以考慮兩步法擴(kuò)增嘗試，對擴(kuò)大片段也許會好些。 3.實在拿不到全長就分開擴(kuò)，一段一段的再連接起來。 4.比較下基因組和cDNA，沒有內(nèi)含子的地方就直接用基因組當(dāng)模板好了。 |
2樓2012-04-25 13:20:37
3樓2012-04-26 17:22:10
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9樓2012-05-02 20:25:03
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