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dfhfzyl鐵蟲 (小有名氣)
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[求助]
大片段PCR(2.1K)擴(kuò)增求助
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我要擴(kuò)增一個(gè)片段為2100bp的cDNA 我的目的基因是來自柑橘的基因,柑橘基因組已經(jīng)發(fā)布了. 設(shè)計(jì)引物時(shí),直接選基因cds全長(zhǎng)的頭尾14-22bp, 正反引物的GC比例盡量保持一致了. 我的擴(kuò)增條件是: 模板2ul (模板濃度約為500ng) 正反引物為0.2ul buffer 2ul dNTP 2ul Mgcl2 1.2ul Taq酶 0.2 (我?guī)熜纸ㄗh我在真正擴(kuò)增時(shí)需選擇高保真酶如pfu) ddH2O2調(diào)到20ul體系 PCR條件 94度4min 94度30秒 55度30秒 72度2:10分 30個(gè)循環(huán) 72度10分 4度半小時(shí) 按照以上的程序,我對(duì)6個(gè)目的基因(大小在都在2kB左右)擴(kuò)增了好幾次都沒有明顯的帶出來或者帶很弱,而有一個(gè)基因出現(xiàn)了三條非常弱的帶? 求助高手!!! |
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天使托
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T.Shen
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5樓2012-04-26 18:49:28
【答案】應(yīng)助回帖
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感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-04-25 13:56:50
1949stone: MolEPI+1 2012-05-03 07:27:34
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1949stone: MolEPI+1 2012-05-03 07:27:34
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1.這么大的cDNA確實(shí)不好擴(kuò)，樓主首先要保證模板的質(zhì)量，這是先決條件。 2.如果模板沒問題可以考慮兩步法擴(kuò)增嘗試，對(duì)擴(kuò)大片段也許會(huì)好些。 3.實(shí)在拿不到全長(zhǎng)就分開擴(kuò)，一段一段的再連接起來。 4.比較下基因組和cDNA，沒有內(nèi)含子的地方就直接用基因組當(dāng)模板好了。 |
2樓2012-04-25 13:20:37
3樓2012-04-26 17:22:10
ixido
木蟲 (小有名氣)
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-04-26 21:48:55
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
西瓜: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-04-26 21:48:55
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前幾個(gè)人說的都很重要，就不在贅述了。 建議樓主換好一點(diǎn)的酶，如pfu。然后把延伸時(shí)間加長(zhǎng)，同時(shí)把復(fù)性溫度進(jìn)行優(yōu)化。此外，樓主需要看一看設(shè)計(jì)的引物是不是和模版其他位置有重疊。 還有，國(guó)內(nèi)的聚合酶質(zhì)量沒有想象中的那么好，適當(dāng)?shù)亩嗉右稽c(diǎn)沒事的，摸摸條件，摸好了做個(gè)大的就行了。 |
4樓2012-04-26 18:27:19
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