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donnafeng金蟲 (小有名氣)
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蛋白濃縮沉淀？二硫鍵？
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我的蛋白質(zhì)單體含3個半胱氨酸 可能2-4聚體 ni柱純化后過脫鹽柱 濃縮蛋白時 出現(xiàn)沉淀 用透析袋加聚乙二醇濃縮時 濃縮到一定程度后 蛋白濃縮液在透析帶里是澄清的 擠壓幾次透析帶立刻出現(xiàn)白色沉淀 而用超濾濃縮管濃縮到一定程度后 溶液澄清澄清，槍頭吹打幾次以后立刻出現(xiàn)沉淀 1 到底是為什么呢 是因為吹打或者是擠壓的過程導(dǎo)致二硫鍵的生成嗎？ 如果是這種情況濃縮過程加DTT可以嗎 2 這個蛋白活性形式是二聚體形式 其他來源的這個蛋白有晶體結(jié)構(gòu) 怎么看pdb文件看這個二聚體是不是有二硫鍵連接 用pymol軟件能看出來嗎？ 3 如果活性形式是通過二硫鍵形成的二聚體 是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能讓它以二聚體的形式存在而不是其他形式存在呢？ 4 我的這個蛋白是胞內(nèi)酶 大腸桿菌胞內(nèi)是還原性條件 是不是所有胞內(nèi)酶都沒有二硫鍵 而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎細胞這一步的時候就因該加DTT [ Last edited by donnafeng on 2012-5-2 at 11:02 ] |
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吹打它或者是擠壓透析袋， 不過是一個誘導(dǎo)體系有不穩(wěn)定狀態(tài)到穩(wěn)定狀態(tài)的一個因素 就像水在加熱時，有時超過沸點不沸騰，用玻璃棒摩擦一下杯壁馬上沸騰 當(dāng)然，水在凝結(jié)過程中也有類似現(xiàn)象發(fā)生 還有過飽和溶液析出溶質(zhì)時，也是這樣！ 形成二硫鍵是化學(xué)反應(yīng)，那么低濃度的溶液，反應(yīng)速度絕不會有那么快，何況氧氣溶解速度也不會如此迅速的！ |
4樓2012-05-02 17:52:12
【答案】應(yīng)助回帖
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1 到底是為什么呢 是因為吹打或者是擠壓的過程導(dǎo)致二硫鍵的生成嗎？ 如果是這種情況濃縮過程加DTT可以嗎 白色沉淀應(yīng)該是由于蛋白質(zhì)在脫鹽（透析、超濾）后，溶液中的鹽濃度降低后，蛋白質(zhì)表面的帶電集團相互作用形成鹽鍵，引起蛋白質(zhì)聚集，和二硫鍵的應(yīng)該是關(guān)系不大，其他蛋白質(zhì)脫鹽后，也有可能會聚集而沉降的。 2 這個蛋白活性形式是二聚體形式 其他來源的這個蛋白有晶體結(jié)構(gòu) 怎么看pdb文件看這個二聚體是不是有二硫鍵連接 用pymol軟件能看出來嗎？ 這個軟件沒有用過。一般軟件是以不同的顏色顯示所有半胱氨酸殘基，看硫原子之間的空間關(guān)系，原子間的距離不知道能否顯示，能的話直接讀取距離，判斷有無化學(xué)鍵形成 3 如果活性形式是通過二硫形成的二聚體 是不是就不能加DTT呢？ 怎么才能讓它以二聚體的形式存在而不是其他形式存在呢？ 這個就不懂了，在體外較難操作。最好是保持和體內(nèi)存在時一直的pH值，鹽濃度，讓蛋白構(gòu)象不發(fā)生變化，其他半胱氨酸殘基在空間上不能接近就好了 4 我的這個蛋白是胞內(nèi)酶 大腸桿菌胞內(nèi)是還原性條件 是不是所有胞內(nèi)酶都沒有二硫鍵 而是以半胱氨酸的活性形式存在？那是不是在破碎細胞這一步的時候就因該加DTT 這些就不明白了。 |
2樓2012-05-02 14:49:44
donnafeng
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<大腸桿菌二硫鍵形成相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其在基因工程表達外源蛋白上的應(yīng)用>張眾黃華木梁 這篇文章里說“體內(nèi)蛋白質(zhì)二硫鍵的形成是在細胞中特定的部位完成 的。在大腸桿菌中，二硫鍵的形成一般僅限于細胞膜蛋白和 分泌蛋白［2］。大腸桿菌的胞質(zhì)是一高度還原的環(huán)境，不包含 具有穩(wěn)定二硫鍵的蛋白［5］。而且，許多胞質(zhì)還原酶必須以巰 基為活性基團，所以胞質(zhì)中存在特定的還原系統(tǒng)確保蛋白巰 基的還原狀態(tài)［8-10］。高度氧化的大腸桿菌周質(zhì)腔具有形成 二硫鍵所具備的一切條件，尤其是具有形成二硫鍵所必需的 酶類———Dsb蛋白，事實上，大腸桿菌蛋白質(zhì) 二硫鍵的形成大多都是在周質(zhì)腔完成的［11］�！� 我的理解就是大腸桿菌胞質(zhì)里的酶就是沒有二硫鍵的 除非是膜蛋白或者分泌蛋白 |
9樓2012-05-03 14:05:30
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濃度高了都會沉淀，有時候表象你看不出來，但是加入外力后瞬間表現(xiàn)。這可能是你吹打造成的，或者是蛋白已經(jīng)過飽和，吹打后表現(xiàn)出來了。 可以考慮增加鹽濃度，加入穩(wěn)定劑，或者底物或者底物類似物。 pdb文件很多工具都可以打開，pymol， wincoot。后者我們解析結(jié)構(gòu)時候多用。 沒說二聚體是搞二硫鍵形成的吧，即使靠加入dtt或者β巰基乙醇也是可以的。二者在pH7-8之間的半衰期都很短，幾十分鐘到幾小時。具體時間不記得了，自己查查吧，和溫度 ph有密切關(guān)系。 他們在降解的過程中二硫鍵緩慢形成趨于穩(wěn)定。 多數(shù)半胱氨酸都是游離形式的，形成二硫鍵的情況一般不多。 |
10樓2012-05-03 16:10:40
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