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[求助]
載體酶切連接
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這個(gè)問(wèn)題已經(jīng)要把握折磨死了，已經(jīng)第四次失敗了.... 載體5.4Kb， 使用XhoI酶切（50ul 體系，5ul 酶，3ug DNA， 5小時(shí) 37度，NEB 新購(gòu)的酶），插入片段大小為1k。最初我使用1%的gel來(lái)cut片段，后來(lái)怕線性的未切割的和supercoil不能分離沖鋒而造成割膠時(shí)候的誤差后來(lái)?yè)Q成0.6%的gel。我特意使用從gel上割下的載體直接電轉(zhuǎn)移TOP 10 Electrocompetent cell， 來(lái)驗(yàn)證載體是否酶切完全。神啊，每次都是超多的克隆。結(jié)果我的載體酶連control自然也是很多克隆。我特意還將酶連產(chǎn)物進(jìn)行了跑膠，只有兩條帶：載體和插入物。我也跑了載體切割前后的樣品，線性載體快于supercoil，但蠻近。而且線性載體那條lane只有一條帶，所以應(yīng)該沒(méi)有污染啊。 煩死了，求助啊...即使告訴我怎么讓supercoil和線性載體跑的很開(kāi)的辦法也好。 順便說(shuō)下我的載體無(wú)論是用CIP還是antarctic phosphatase都試過(guò) [ Last edited by 593318518 on 2012-5-3 at 09:17 ] |
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susizheng
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【答案】應(yīng)助回帖
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單酶切載體回收后轉(zhuǎn)化感受態(tài)驗(yàn)證是否酶切完全，意義不大，細(xì)胞都有修復(fù)功能，轉(zhuǎn)化后可以重新環(huán)化的。個(gè)人認(rèn)為載體想要酶切完全，可以每個(gè)酶切體系少加載體量（ug級(jí)以下），酶切時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)更好。 另外不知道你去磷酸化是怎么做的？ 另外沒(méi)連上，酶連體系也很重要。 |
3樓2012-05-03 11:07:13
hyacinth326
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【答案】應(yīng)助回帖
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593318518: 金幣+10 2012-05-08 09:21:14
| 為什么是電轉(zhuǎn)�。侩娹D(zhuǎn)的話，線性的也能進(jìn)入細(xì)胞啊，而這些感受態(tài)細(xì)胞都是經(jīng)過(guò)改造的，可能會(huì)修復(fù)一些質(zhì)粒，這樣長(zhǎng)菌落很正常啊，而且線性條帶應(yīng)該比超螺旋的慢才對(duì)啊 |
2樓2012-05-03 09:17:43
4樓2012-05-03 21:57:56
5樓2012-05-03 22:03:09
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