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rebornpro鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR產(chǎn)生非特異性帶
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RT，最近PCR摸索條件，引物單子上寫的退火溫度是45°（好低啊），這個是45°退火P出來的圖，MARKER是DL2000，很奇怪，PCR產(chǎn)物的理論值應(yīng)該是900多的樣子（上面那個不亮的帶），結(jié)果產(chǎn)物只有500的樣子�，F(xiàn)在不管產(chǎn)物大小了，就把那個不亮的當非特異性帶吧。如何改進PCR條件把這個非特異性帶給它去掉。求人解答。 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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xiaoxiong520
銀蟲 (初入文壇)
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rebornpro: 金幣+5, ★★★很有幫助 2012-05-10 17:22:28
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1、引物的特異性較差。這種情況下，可能會出現(xiàn)很難消除的非特異性擴增；如果模板好的話，多半會有目的片斷出現(xiàn)。 2、模板不好。比如，RNA提取得不好，里面有基因組DNA污染或RNA降解比較嚴重，最終導致cDNA的質(zhì)量不好。 3、Taq酶出現(xiàn)了問題。保存不當會導致活性改變，從而容易擴出非特異性條帶； 若確定引物設(shè)計沒有問題，以及模板的純化外，Mg2+濃度過高也會導致非特異性擴增的。還有一個問題就是 可能你的目的基因GC含量比較高，這個可以用軟件分析一下，如果GC含量高或者有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，普通的Taq很難擴增出目的基因。 |
rebornpro3樓2012-05-10 10:17:25
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5樓2012-05-10 10:32:16
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