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addictedfish鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
急救啊！各位大蝦，PCR擴基因有雜帶(有圖)！
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大家好！我是實驗菜鳥，從油菜基因組直接P基因。都快一個月了，天天作重復(fù)工作，該考慮都考慮了，但是就是擴不出來東西�！，F(xiàn)就把PCR體系和反應(yīng)程序列出來。請各位大蝦們多多指教啊 ？ 體系：10 x buffer 2.5ul， dNTP (2.5mM each) 3ul, 25mM Mg+ 2ul , 上下引物各 1ul, 基因組DNA 3ul, 2.5U/ul Taq酶 0.4ul 加水至25ul 反應(yīng)程序： 94 3min 94 30s 52 1mim 72 2min 共 32個循環(huán)。 72 3min 這是我做的最好的一次，我要上面的帶，但是下面的非特異性帶更亮啊？大家?guī)臀铱纯础?br /> 圖 |
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mascotte
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【答案】應(yīng)助回帖
★ ★ ★
silicare(金幣+3, BioEPI+1): 可以考慮 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金幣+6): 謝謝您的回帖，是要做轉(zhuǎn)基因的。連克隆載體的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金幣+4): 2011-11-29 10:07:10
silicare(金幣+3, BioEPI+1): 可以考慮 2011-10-24 12:12:07
addictedfish(金幣+6): 謝謝您的回帖，是要做轉(zhuǎn)基因的。連克隆載體的。 2011-10-24 15:52:36
addictedfish(金幣+4): 2011-11-29 10:07:10
| 引物設(shè)計的有問題吧，把引物在ncbi上blast一下，看看有沒有其他的基因能被擴增出來。一些基因有結(jié)構(gòu)相似的假基因（pseudogene），一些基因家族有保守型的結(jié)構(gòu)域，如果你的引物設(shè)計在這些位置就沒啥特異性了。如果PCR的目的是擴增要構(gòu)建質(zhì)粒的基因，可以把位置符合條件的條帶切下來再PCR；如果是為了做半定量PCR就重新設(shè)計引物吧。 |
2樓2011-10-24 11:18:53
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4樓2011-10-25 12:32:23
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8樓2011-10-26 22:16:56
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9樓2011-11-13 20:12:25
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10樓2011-11-17 10:36:00
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