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rebornpro鐵蟲 (初入文壇)
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[求助]
PCR產(chǎn)生非特異性帶
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RT，最近PCR摸索條件，引物單子上寫的退火溫度是45°（好低�。�，這個(gè)是45°退火P出來的圖，MARKER是DL2000，很奇怪，PCR產(chǎn)物的理論值應(yīng)該是900多的樣子（上面那個(gè)不亮的帶），結(jié)果產(chǎn)物只有500的樣子�，F(xiàn)在不管產(chǎn)物大小了，就把那個(gè)不亮的當(dāng)非特異性帶吧。如何改進(jìn)PCR條件把這個(gè)非特異性帶給它去掉。求人解答。 |
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孫啟亮
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4樓2012-05-10 10:30:49
cheng_xiao
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| 看你的圖片一個(gè)是膠制作的不好或者你的電泳儀器不好，把條帶都跑歪了�？茨愕牡膱D改進(jìn)PCR條件效果應(yīng)該不佳，因?yàn)槟愕姆翘禺愋詶l帶比特異性條帶亮的多，說明你引物在另一片段結(jié)合的趨勢(shì)比期望位置更好，所以你提高PCR溫度反而致使你的特異性條帶沒有了，所以建議你另設(shè)計(jì)引物，你也可以做個(gè)反向pcr或者RACE之類的，實(shí)驗(yàn)順利啊 |
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rebornpro
2樓2012-05-10 09:54:12
xiaoxiong520
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1、引物的特異性較差。這種情況下，可能會(huì)出現(xiàn)很難消除的非特異性擴(kuò)增；如果模板好的話，多半會(huì)有目的片斷出現(xiàn)。 2、模板不好。比如，RNA提取得不好，里面有基因組DNA污染或RNA降解比較嚴(yán)重，最終導(dǎo)致cDNA的質(zhì)量不好。 3、Taq酶出現(xiàn)了問題。保存不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致活性改變，從而容易擴(kuò)出非特異性條帶； 若確定引物設(shè)計(jì)沒有問題，以及模板的純化外，Mg2+濃度過高也會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的。還有一個(gè)問題就是 可能你的目的基因GC含量比較高，這個(gè)可以用軟件分析一下，如果GC含量高或者有復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，普通的Taq很難擴(kuò)增出目的基因。 |
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3樓2012-05-10 10:17:25
孫啟亮
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5樓2012-05-10 10:32:16
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