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shiliu2011木蟲 (正式寫手)
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[交流]
PCR緩沖液（PCr Buffer） 已有12人參與
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從網(wǎng)上看到的，很不錯，發(fā)到這里和大家一起學習咯！ 用于PCR的標準緩沖液見PCR操作范例。于72℃時，反應體系的pH值將下降1個單位，接近于7.2。二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實驗表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無任何作用。 1．Mg2+濃度Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L(當各種dNTP濃度為200mmol/L時)，但并非對任何一種模板與引物的結合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結合時，都要把Mg2+濃度調到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2+過量易生成非特異性擴增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。 樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負電荷的離子基團如磷酸根，會與Mg2+結合而降低Mg2+有效濃度。因此，用作模板的DNA應溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。 dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標準反應體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時，必須相應調整Mg2+的濃度。 2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。 3．KCl濃度K+濃度在50mmol/L 時能促進引物退火。但現(xiàn)在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時，KCl濃度高于50mmol/L將會抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對PCR結果沒有太大影響。 4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結果，影響不大。 5．二甲基亞砜（DMSO） 在使用Klenow片段進行PCR時DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級結構，使（G+C）%含量高的模板易于完全變性，在反應體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測序更易進行，但超過10%時會抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用DMSO。 6．甘油：保護Taq酶，增加酶的穩(wěn)定性，以提高產(chǎn)量   歡迎補充！ [ Last edited by shiliu2011 on 2012-6-4 at 19:41 ] |
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 分子生化實驗經(jīng)驗積累 | PCR技術 | 基因工程、分子技術、微生物理論 | 蛋白表達純化鑒定精華 |
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5樓2012-08-02 12:26:14
感謝樓主分享，下次可以試著自己做一下，我現(xiàn)在都是買的 
2樓2012-06-05 08:57:17
3樓2012-07-31 23:02:33
shiliu2011
木蟲 (正式寫手)
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4樓2012-08-02 01:13:35
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