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shiliu2011木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)
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[交流]
PCR緩沖液（PCr Buffer） 已有12人參與
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從網(wǎng)上看到的，很不錯(cuò)，發(fā)到這里和大家一起學(xué)習(xí)咯！ 用于PCR的標(biāo)準(zhǔn)緩沖液見(jiàn)PCR操作范例。于72℃時(shí)，反應(yīng)體系的pH值將下降1個(gè)單位，接近于7.2。二價(jià)陽(yáng)離子的存在至關(guān)重要，影響PCR的特異性和產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)表明，Mg2+優(yōu)于Mn2+，而Ca2+無(wú)任何作用。 1．Mg2+濃度Mg2+的最佳濃度為1.5mmol/L(當(dāng)各種dNTP濃度為200mmol/L時(shí))，但并非對(duì)任何一種模板與引物的結(jié)合都是最佳的。首次使用靶序列和引物結(jié)合時(shí)，都要把Mg2+濃度調(diào)到最佳，其濃度變化范圍為1～10mmol/L。Mg2+過(guò)量易生成非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，Mg2+不足易使產(chǎn)量降低。 樣品中存在的較高濃度的螯合劑如EDTA或高濃度帶負(fù)電荷的離子基團(tuán)如磷酸根，會(huì)與Mg2+結(jié)合而降低Mg2+有效濃度。因此，用作模板的DNA應(yīng)溶于10mmol/l Tris-HCl(pH7.6)0.1mmol/L EDTA中。 dNTP含有磷酸根，其濃度變化將影響Mg2+的有效濃度。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中4×dTNPs的總濃度為0.8mmol/L，低于1.5mmol/L的Mg2+濃度。因此，在高濃度DNA及dNTP條件時(shí)，必須相應(yīng)調(diào)整Mg2+的濃度。 2．Tris -HCl緩沖液在PCR中使用10～50mmol/L的Tris –HCl緩沖液，很少使用其他類(lèi)型的緩沖液。Tris緩沖液是一種雙極化的離子緩沖液，pKa為8.3(20℃),△pKa為0.021/℃。因此，20mmol/l Tris pH8.3(20℃)時(shí)，在典型的熱循環(huán)條件下，真正的pH值在7.8～6.8之間。 3．KCl濃度K+濃度在50mmol/L 時(shí)能促進(jìn)引物退火。但現(xiàn)在的研究表明，NaCl濃度在50mmol/L時(shí)，KCl濃度高于50mmol/L將會(huì)抑制Taq酶的活性，少加或不加KCl對(duì)PCR結(jié)果沒(méi)有太大影響。 4．明膠明膠和BSA或非離子型去垢劑具有穩(wěn)定酶的作用。一般用量為100μg/ml，但現(xiàn)在的研究表明，加或不加都能得到良好和PCR結(jié)果，影響不大。 5．二甲基亞砜（DMSO） 在使用Klenow片段進(jìn)行PCR時(shí)DMSO是有用的；加入10%DM－SO有利于減少DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使（G+C）%含量高的模板易于完全變性，在反應(yīng)體系中加入DMSO使PCR產(chǎn)物直接測(cè)序更易進(jìn)行，但超過(guò)10%時(shí)會(huì)抑制Taq DNA聚合酶的活性，因此，大多數(shù)并不使用DMSO。 6．甘油：保護(hù)Taq酶，增加酶的穩(wěn)定性，以提高產(chǎn)量   歡迎補(bǔ)充！ [ Last edited by shiliu2011 on 2012-6-4 at 19:41 ] |
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 分子生化實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)積累 | PCR技術(shù) | 基因工程、分子技術(shù)、微生物理論 | 蛋白表達(dá)純化鑒定精華 |
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q317476148
鐵桿木蟲(chóng) (著名寫(xiě)手)
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9樓2012-12-29 12:51:04
guifang
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感謝樓主分享，下次可以試著自己做一下，我現(xiàn)在都是買(mǎi)的 2樓2012-06-05 08:57:17
3樓2012-07-31 23:02:33
shiliu2011
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4樓2012-08-02 01:13:35
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