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[求助]
新手，引物設計不懂啊。。求介紹啊
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1、我從NCBI下了所需要的序列 2、我把序列粘貼到PRIMER5.0 3、到設置那個上游引物 跟下游引物長度的時候，不知道該怎么設啊。 還有那個PCR目標產(chǎn)物長度。 我要設計的引物基因在序列【總長2034 bp DNA】 的位置是291..899 另外一個的位置是在912..1784 【要設計這兩個基因的引物】 還有完了，之后要怎么看到底好不好 |
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xw19880905
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2樓2012-07-19 11:42:16
linchenyu
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【答案】應助回帖
感謝參與，應助指數(shù) +1
| 關(guān)于設計siRNA以及siRNA設計對siRNA功能的影響，還沒有可靠的規(guī)律。雖然可以通過對mRNA實驗分析準確的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但這個過程十分耗時且昂貴，不推薦常規(guī)實驗使用。一種做法是每個目標序列設計3－4對siRNAs，實驗選擇較有效的siRNA。 siRNA設計大都根據(jù)Tuschl的實驗，要點如下： 1.目標基因開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個堿基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19個堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA）。 設計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)。 2.分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。 3.將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。 4.如果選擇shRNA，有報道顯示9個寡核苷酸的環(huán)是最有效的。 下面是另一個設計的版本，大致相同： 1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。 2. 將潛在的序列和相應的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 3. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 負對照 一個完整的siRNA實驗應該有負對照，作為負對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。 如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。 現(xiàn)在Qiagen公司的網(wǎng)站上有完整的siRNA 的設計方法，可以自動設計并生成多個備選序列，并且可以自動連接到基因組數(shù)據(jù)庫進行檢索比對。 |
3樓2012-07-19 17:34:51
linchenyu
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【答案】應助回帖
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制備 體外制備 1.化學合成 許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素 2.體外轉(zhuǎn)錄 以DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。 最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。 不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。 3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因�，F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。 最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型 不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療 體內(nèi)表達 前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。 4. siRNA表達載體 多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。 siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。 最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。 不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。 5. siRNA表達框架 siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。 這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想。 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子 不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） |
4樓2012-07-19 17:35:48
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