 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1637 | 回復(fù): 5 | |||
[求助]
新手，引物設(shè)計不懂啊。。求介紹啊
|
|
1、我從NCBI下了所需要的序列 2、我把序列粘貼到PRIMER5.0 3、到設(shè)置那個上游引物 跟下游引物長度的時候，不知道該怎么設(shè)啊。 還有那個PCR目標產(chǎn)物長度。 我要設(shè)計的引物基因在序列【總長2034 bp DNA】 的位置是291..899 另外一個的位置是在912..1784 【要設(shè)計這兩個基因的引物】 還有完了，之后要怎么看到底好不好 |
回復(fù)此樓» 收錄本帖的淘帖專輯推薦
 重組的景區(qū) |
» 猜你喜歡
不合理蛙科研實驗之小鼠實驗：嚴謹設(shè)計，解析生命機制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之重金屬檢測：精準篩查，守護健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學工程及工業(yè)化學論文潤色/翻譯怎么收費?
已經(jīng)有259人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“蛙測重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實驗之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專業(yè)碩士，坐標南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
-
邵陽學院食品與化學工程學院碩士調(diào)劑
已經(jīng)有0人回復(fù)
» 本主題相關(guān)價值貼推薦，對您同樣有幫助:
- 分子新手，誠心向各位朋友求教PCR引物設(shè)計，謝謝！
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 新手求助：設(shè)計引物的困惑
已經(jīng)有3人回復(fù)
- 求助-基因克隆及引物設(shè)計的問題
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 求引物設(shè)計高手
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 要P一段基因全長，已知CDS，怎么設(shè)計引物啊？
已經(jīng)有10人回復(fù)
- primer5設(shè)計的引物要打分多少高比較好啊
已經(jīng)有11人回復(fù)
- 已經(jīng)帶his標簽?zāi)康牡鞍谆蛉绾卧O(shè)計引物啊（目的基因已經(jīng)接在pET-22b的載體上了）
已經(jīng)有8人回復(fù)
- PCR最短可以P多少bp，求大家?guī)臀以O(shè)計引物！
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 新手請教引物里的為什么會出現(xiàn)非ATGC字母？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- P450酶
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 【求助/交流】請做過RAPD的蟲子支招
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 【求助/交流】多重PCR引物設(shè)計
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】引物設(shè)計原則說3‘端避開密碼子第3位，何解？
已經(jīng)有15人回復(fù)
- 【求助/交流】新手請教如何對不同物種中某一酶的氨基酸序列進行比對再設(shè)計簡并引物啊?/a>
已經(jīng)有10人回復(fù)
xw19880905
新蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 24 (小學生)
- 金幣: 419.1
- 帖子: 74
- 在線: 10.4小時
- 蟲號: 1530022
- 注冊: 2011-12-09
- 專業(yè): 系統(tǒng)生物學
2樓2012-07-19 11:42:16
linchenyu
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 864.3
- 帖子: 65
- 在線: 78.6小時
- 蟲號: 1578292
- 注冊: 2012-01-15
- 性別: MM
- 專業(yè): 腫瘤研究體系新技術(shù)
【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
| 關(guān)于設(shè)計siRNA以及siRNA設(shè)計對siRNA功能的影響，還沒有可靠的規(guī)律。雖然可以通過對mRNA實驗分析準確的找到一段基因的全部siRNA最佳作用位置，但這個過程十分耗時且昂貴，不推薦常規(guī)實驗使用。一種做法是每個目標序列設(shè)計3－4對siRNAs，實驗選擇較有效的siRNA。 siRNA設(shè)計大都根據(jù)Tuschl的實驗，要點如下： 1.目標基因開放閱讀框起始密碼下游75至100堿基位置開始，尋找“AA”二連序列后的19個堿基序列。（用非“AA”的“XY”序列后的19個堿基序列同樣可以得到很好效果的siRNA）。 設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)。 2.分析獲得的序列，選擇GC比在40-55%之間的靶基因序列作為優(yōu)選。 3.將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST等。 4.如果選擇shRNA，有報道顯示9個寡核苷酸的環(huán)是最有效的。 下面是另一個設(shè)計的版本，大致相同： 1. 從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結(jié)果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為效。Tuschl等建議在設(shè)計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié)合mRNA從而影響siRNA的效果。 2. 將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST 3. 選出合適的目標序列進行合成。通常一個基因需要設(shè)計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。 負對照 一個完整的siRNA實驗應(yīng)該有負對照，作為負對照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常的做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和其他基因沒有同源性。 如果計劃合成siRNA，那么可以直接提供以AA打頭的21個堿基序列，廠家會合成一對互補的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT結(jié)尾，如果要UU結(jié)尾的話通常要特別說明。有結(jié)果顯示，UU結(jié)尾和dTdT結(jié)尾的siRNA在效果上沒有區(qū)別。因為這個突出端無需和靶序列互補。 現(xiàn)在Qiagen公司的網(wǎng)站上有完整的siRNA 的設(shè)計方法，可以自動設(shè)計并生成多個備選序列，并且可以自動連接到基因組數(shù)據(jù)庫進行檢索比對。 |
3樓2012-07-19 17:34:51
linchenyu
鐵蟲 (小有名氣)
- 應(yīng)助: 9 (幼兒園)
- 金幣: 864.3
- 帖子: 65
- 在線: 78.6小時
- 蟲號: 1578292
- 注冊: 2012-01-15
- 性別: MM
- 專業(yè): 腫瘤研究體系新技術(shù)
【答案】應(yīng)助回帖
|
制備 體外制備 1.化學合成 許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究 不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素 2.體外轉(zhuǎn)錄 以DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。 最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。 不適用于：實驗需要大量的，一個特定的siRNA。長期研究。 3.用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA 其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——制備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000堿基的靶mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 dsRNA消化法的主要優(yōu)點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。 最適用于：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型 不適用于：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的siRNA進行研究，特別是基因治療 體內(nèi)表達 前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs，并且需要專門的RNA轉(zhuǎn)染試劑將siRNAs轉(zhuǎn)到細胞內(nèi)。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到siRNAs。這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作RNA。 4. siRNA表達載體 多數(shù)的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過添加一串（3到6個）U來終止轉(zhuǎn)錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。 siRNA表達載體的優(yōu)點在于可以進行較長期研究——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 病毒載體也可用于siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。 最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。 不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。 5. siRNA表達框架 siRNA表達框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達siRNA和長效抑制的研究。 這個方法的主要缺點是①PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中（晶賽公司的Protocol可以解決這一問題）②不能進行序列測定，PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子 不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） |
4樓2012-07-19 17:35:48
aoda123
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 20 (小學生)
- 金幣: 2465.2
- 散金: 25
- 紅花: 3
- 沙發(fā): 1
- 帖子: 626
- 在線: 604.8小時
- 蟲號: 1907221
- 注冊: 2012-07-23
- 性別: GG
- 專業(yè): 病原微生物與感染其他科學
5樓2012-07-27 15:28:21
scutphoenix
木蟲 (正式寫手)
- 應(yīng)助: 8 (幼兒園)
- 金幣: 2294.6
- 散金: 150
- 紅花: 1
- 帖子: 520
- 在線: 53.8小時
- 蟲號: 348663
- 注冊: 2007-04-18
- 專業(yè): 病毒學
6樓2012-07-28 00:23:04
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 chuxuan 的主題更新
| 6 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 22408 359分調(diào)劑 +3 | Qshers 2026-03-27 | 4/200 |
|
|---|---|---|---|---|
|
|
[考研] 材料與化工272求調(diào)劑 +9 | 阿斯蒂芬2004 2026-03-28 | 9/450 |
|
|
|
[考研] 一志愿中南大學化學0703總分337求調(diào)劑 +5 | niko- 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 347求調(diào)劑 +3 | 山頂見α 2026-03-25 | 3/150 |
|
|
|
[考研]
 一志愿武漢理工，總分321，英一數(shù)二，求老師收留。
+6
|
nnnnnnn5 2026-03-25 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 339求調(diào)劑，想調(diào)回江蘇 +6 | 烤麥芽 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
[考研]
材料與化工考研調(diào)劑
+17
|
孅華 2026-03-22 | 17/850 |
|
|
|
[考研] 303求調(diào)劑 +7 | 安憶靈 2026-03-22 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 材料求調(diào)劑 +5 | .m.. 2026-03-25 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 292求調(diào)劑 +4 | 求求了收下我吧?/a> 2026-03-26 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 材料調(diào)劑 +8 | 匹克i 2026-03-23 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 324求調(diào)劑 +8 | hanamiko 2026-03-26 | 10/500 |
|
|
|
[考研] 生物學 296 求調(diào)劑 +4 | 朵朵- 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 0854人工智能方向招收調(diào)劑 +4 | 章小魚567 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 293求調(diào)劑 +7 | 加一一九 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 340求調(diào)劑 +5 | 話梅糖111 2026-03-24 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑一志愿武漢理工大學材料工程（085601） +5 | WW.' 2026-03-23 | 7/350 |
|
|
|
[考研]
 085404電子信息284分求調(diào)劑
+4
|
13659058978 2026-03-24 | 4/200 |
|
|
|
[考博] 26申博自薦 +3 | whh869393 2026-03-24 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +5 | Zhangbod 2026-03-21 | 7/350 |
|