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Marado

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[交流] 表達(dá)蛋白折疊不正確會(huì)有活性麼？

如題，37℃，1mMIPTG，6h，表達(dá)細(xì)胞超聲波破碎后，離心，SDS-PAGE顯示，上清跟沉淀都有目的蛋白，但是沉淀明顯更多，測(cè)定了上清酶活（底物為海藻酸鈉），有活性，但是做純化的時(shí)候悲劇了，死活掛不上柱子，蛋白都在流川液中.
有朋友說(shuō)，試試低溫誘導(dǎo)，減少包涵體，這里我有幾個(gè)疑問(wèn)
1：我上清中明顯是有目的蛋白的，也有酶活，為何掛不上柱子，莫非是誘導(dǎo)溫度過(guò)高，翻譯過(guò)快，把GST折疊進(jìn)去了，所以?huà)觳簧�，但是這樣的話(huà)，蛋白豈不是也沒(méi)有活性的？可事實(shí)是有的……
2：有表達(dá)有酶活是否等于折疊正確？

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1樓 2012-09-20 10:51:12

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dshlove

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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小木蟲(chóng): 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵(lì)積極解答問(wèn)題 2012-09-20 15:37:07

引用回帖:

3樓: Originally posted by Marado at 2012-09-20 12:10:17
十分感謝，那如何能夠減少標(biāo)簽的二聚體形成呢？
減少溫度或者降低IPTG的濃度是否有用？
還有酶切的話(huà)，直接對(duì)蛋白進(jìn)行酶切嘛？對(duì)蛋白酶切不太了解

...

至于二聚體的形成，這好像和你用的質(zhì)粒還有宿主有關(guān)系，涉及基因調(diào)控表達(dá)方面的了，怎么減少我沒(méi)具體方案。不過(guò)，既然是表達(dá)過(guò)程形成的，我們可以降低宿主的表達(dá)速度，使蛋白有條不紊的折疊，我覺(jué)得就能降低二聚體的形成。
降低溫度肯定是要的，IPTG濃度能用低的就不要高的。

酶切是看你在標(biāo)簽和蛋白之間有沒(méi)有設(shè)計(jì)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)。比如說(shuō)TEV，EK之類(lèi)的特異性位點(diǎn)。
我之前說(shuō)的酶切是讓你檢驗(yàn)一下你的標(biāo)簽有沒(méi)有被包裹，酶切之后會(huì)不會(huì)影響活性。

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4樓2012-09-20 12:41:24

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dshlove

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Marado(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+5, 熱心的蟲(chóng)蟲(chóng) 2012-09-20 15:36:38

GST標(biāo)簽本身就是比較特殊的，表達(dá)時(shí)候容易形成標(biāo)簽的二聚體，而標(biāo)簽的二聚體是不掛柱的。所以，能用his就用his。
還有就是你說(shuō)的，可能是溫度高了，來(lái)不及正確折疊，就把標(biāo)簽給包裹了。
不知道你有沒(méi)有酶切位點(diǎn)，酶切之后看看還有沒(méi)有活性。

酶活和折疊正確與否關(guān)系不大，因?yàn)槊總€(gè)蛋白或者酶都有一個(gè)活性中心，只要這個(gè)活性中心沒(méi)變性，那么酶或者蛋白還是能起作用的。
比如說(shuō)，腸激酶是兩個(gè)亞基組成，其實(shí)起作用的只是那個(gè)輕鏈。
希望能幫上。

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Marado

2樓2012-09-20 11:09:19

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Marado

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送鮮花一朵

引用回帖:

2樓: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 11:09:19
GST標(biāo)簽本身就是比較特殊的，表達(dá)時(shí)候容易形成標(biāo)簽的二聚體，而標(biāo)簽的二聚體是不掛柱的。所以，能用his就用his。
還有就是你說(shuō)的，可能是溫度高了，來(lái)不及正確折疊，就把標(biāo)簽給包裹了。
不知道你有沒(méi)有酶切位點(diǎn)， ...

十分感謝，那如何能夠減少標(biāo)簽的二聚體形成呢？
減少溫度或者降低IPTG的濃度是否有用？
還有酶切的話(huà)，直接對(duì)蛋白進(jìn)行酶切嘛？對(duì)蛋白酶切不太了解

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3樓2012-09-20 12:10:17

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引用回帖:

4樓: Originally posted by dshlove at 2012-09-20 12:41:24
至于二聚體的形成，這好像和你用的質(zhì)粒還有宿主有關(guān)系，涉及基因調(diào)控表達(dá)方面的了，怎么減少我沒(méi)具體方案。不過(guò)，既然是表達(dá)過(guò)程形成的，我們可以降低宿主的表達(dá)速度，使蛋白有條不紊的折疊，我覺(jué)得就能降低二聚體 ...

行！謝謝了！我考慮做一下低溫誘導(dǎo)，還有一個(gè)問(wèn)題就是，我之前250ml菌液，破3秒，停5秒，破碎了將近半小時(shí)，都沒(méi)有透明，還是有很多的白色狀沉淀，請(qǐng)問(wèn)，這個(gè)是包涵體麼？

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5樓2012-09-20 12:47:29

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