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[交流]
表達蛋白折疊不正確會有活性麼？
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如題，37℃，1mMIPTG，6h，表達細胞超聲波破碎后，離心，SDS-PAGE顯示，上清跟沉淀都有目的蛋白，但是沉淀明顯更多，測定了上清酶活（底物為海藻酸鈉），有活性，但是做純化的時候悲劇了，死活掛不上柱子，蛋白都在流川液中. 有朋友說，試試低溫誘導，減少包涵體，這里我有幾個疑問 1：我上清中明顯是有目的蛋白的，也有酶活，為何掛不上柱子，莫非是誘導溫度過高，翻譯過快，把GST折疊進去了，所以掛不上，但是這樣的話，蛋白豈不是也沒有活性的？可事實是有的…… 2：有表達有酶活是否等于折疊正確？ |
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Marado(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+5, 熱心的蟲蟲 2012-09-20 15:36:38
Marado(金幣+1): 謝謝參與
小丹木木: 金幣+5, 熱心的蟲蟲 2012-09-20 15:36:38
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GST標簽本身就是比較特殊的，表達時候容易形成標簽的二聚體，而標簽的二聚體是不掛柱的。所以，能用his就用his。 還有就是你說的，可能是溫度高了，來不及正確折疊，就把標簽給包裹了。 不知道你有沒有酶切位點，酶切之后看看還有沒有活性。 酶活和折疊正確與否關系不大，因為每個蛋白或者酶都有一個活性中心，只要這個活性中心沒變性，那么酶或者蛋白還是能起作用的。 比如說，腸激酶是兩個亞基組成，其實起作用的只是那個輕鏈。 希望能幫上。 |
Marado2樓2012-09-20 11:09:19
3樓2012-09-20 12:10:17
★ ★ ★ ★
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極解答問題 2012-09-20 15:37:07
小木蟲: 金幣+0.5, 給個紅包，謝謝回帖
小丹木木: 金幣+3, MolEPI+1, 鼓勵積極解答問題 2012-09-20 15:37:07
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至于二聚體的形成，這好像和你用的質粒還有宿主有關系，涉及基因調控表達方面的了，怎么減少我沒具體方案。不過，既然是表達過程形成的，我們可以降低宿主的表達速度，使蛋白有條不紊的折疊，我覺得就能降低二聚體的形成。 降低溫度肯定是要的，IPTG濃度能用低的就不要高的。 酶切是看你在標簽和蛋白之間有沒有設計相應的酶切位點。比如說TEV，EK之類的特異性位點。 我之前說的酶切是讓你檢驗一下你的標簽有沒有被包裹，酶切之后會不會影響活性。 |
4樓2012-09-20 12:41:24
5樓2012-09-20 12:47:29
6樓2012-09-20 13:24:33
7樓2012-09-20 14:39:45
8樓2012-09-20 15:10:45
9樓2012-09-20 15:25:32
10樓2012-09-20 15:40:15
借你吉言了……第一次做表達，做了4個月了，一路磕磕絆絆，心力憔悴，好容易到最后一步純化了……又遇到檻了…… 11樓2012-09-20 16:10:57
加油啊，人家CSH做一個蛋白不也用了18個月。出來就好，過程很好的，學到東西多。 12樓2012-09-20 16:20:31
13樓2012-09-20 16:32:24
14樓2012-09-20 16:38:32
15樓2012-09-22 11:48:35
16樓2012-09-22 13:50:02
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