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ruililian09銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
我有幾個(gè)克隆和基因重組的基本問題不太清楚，請(qǐng)各位幫幫忙！
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1、DH5α和JM109這兩個(gè)菌株在做克隆時(shí)有什么區(qū)別，我看的文章里，做克隆時(shí)兩者都用。 2、做轉(zhuǎn)化時(shí)，我看文獻(xiàn)里都會(huì)用X-Gal和IPTG來(lái)做藍(lán)白斑篩選，但是我們用T載連接轉(zhuǎn)化到DH5α中的時(shí)候，是不用藍(lán)白斑來(lái)篩選的，出現(xiàn)陽(yáng)性菌落的時(shí)候就挑單菌落做菌落PCR驗(yàn)證，這樣是不是就可以代替藍(lán)白斑篩選了，甚至比前者更有說(shuō)服力？ 3、用BL21和畢赤酵母表達(dá)時(shí)，一般用什么酶與載體連接呢？我的理解是根據(jù)設(shè)計(jì)引物時(shí)加的酶切位點(diǎn)來(lái)定，可不知道為什么老師還讓我查。 4、做易錯(cuò)PCR和DNA Shuffling時(shí)怎么確定重組的條件呢？例如：PCR體系，程序，內(nèi)切酶和無(wú)引物PCR的程序等等。或者摸索重組條件的時(shí)候的依據(jù)有哪些？易錯(cuò)PCR是將突變的堿基控制在一定的范圍之內(nèi)嗎，那不是沒摸索一次就要測(cè)一次序？ |
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2樓2012-09-28 10:59:50
gwd0312
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1949stone: 回帖置頂 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
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1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
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1、 DH5a是一種常用于質(zhì)�？寺〉木�。E.coli DH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)�？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。JM109菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13 phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。 2、嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，藍(lán)白斑篩選還是要做的，篩選出白班之后再做PCR驗(yàn)證，這樣假陽(yáng)性概率就小。 3、選擇酶切位點(diǎn)很重要，不光要切下來(lái)，下一步還要能連接上去，查閱文獻(xiàn)是對(duì)的，好好篩選，挑選常見的，經(jīng)濟(jì)的，連接效率高的。 |
3樓2012-09-28 11:12:46
cicelyzh
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7樓2012-10-07 12:46:08
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