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ruililian09銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
我有幾個(gè)克隆和基因重組的基本問題不太清楚，請(qǐng)各位幫幫忙！
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1、DH5α和JM109這兩個(gè)菌株在做克隆時(shí)有什么區(qū)別，我看的文章里，做克隆時(shí)兩者都用。 2、做轉(zhuǎn)化時(shí)，我看文獻(xiàn)里都會(huì)用X-Gal和IPTG來做藍(lán)白斑篩選，但是我們用T載連接轉(zhuǎn)化到DH5α中的時(shí)候，是不用藍(lán)白斑來篩選的，出現(xiàn)陽性菌落的時(shí)候就挑單菌落做菌落PCR驗(yàn)證，這樣是不是就可以代替藍(lán)白斑篩選了，甚至比前者更有說服力？ 3、用BL21和畢赤酵母表達(dá)時(shí)，一般用什么酶與載體連接呢？我的理解是根據(jù)設(shè)計(jì)引物時(shí)加的酶切位點(diǎn)來定，可不知道為什么老師還讓我查。 4、做易錯(cuò)PCR和DNA Shuffling時(shí)怎么確定重組的條件呢？例如：PCR體系，程序，內(nèi)切酶和無引物PCR的程序等等�；蛘呙髦亟M條件的時(shí)候的依據(jù)有哪些？易錯(cuò)PCR是將突變的堿基控制在一定的范圍之內(nèi)嗎，那不是沒摸索一次就要測一次序？ |
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gwd0312
木蟲 (正式寫手)
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1949stone: 回帖置頂 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
1949stone: 回帖置頂 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
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1、 DH5a是一種常用于質(zhì)粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α－互補(bǔ)�？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。JM109菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)化或用M13 phage載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進(jìn)行α－互補(bǔ)，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。 2、嚴(yán)格來說，藍(lán)白斑篩選還是要做的，篩選出白班之后再做PCR驗(yàn)證，這樣假陽性概率就小。 3、選擇酶切位點(diǎn)很重要，不光要切下來，下一步還要能連接上去，查閱文獻(xiàn)是對(duì)的，好好篩選，挑選常見的，經(jīng)濟(jì)的，連接效率高的。 |
3樓2012-09-28 11:12:46
2樓2012-09-28 10:59:50
cicelyzh
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5樓2012-10-02 22:54:53
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