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我有幾個克隆和基因重組的基本問題不太清楚，請各位幫幫忙！
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1、DH5α和JM109這兩個菌株在做克隆時有什么區(qū)別，我看的文章里，做克隆時兩者都用。 2、做轉(zhuǎn)化時，我看文獻里都會用X-Gal和IPTG來做藍白斑篩選，但是我們用T載連接轉(zhuǎn)化到DH5α中的時候，是不用藍白斑來篩選的，出現(xiàn)陽性菌落的時候就挑單菌落做菌落PCR驗證，這樣是不是就可以代替藍白斑篩選了，甚至比前者更有說服力？ 3、用BL21和畢赤酵母表達時，一般用什么酶與載體連接呢？我的理解是根據(jù)設計引物時加的酶切位點來定，可不知道為什么老師還讓我查。 4、做易錯PCR和DNA Shuffling時怎么確定重組的條件呢？例如：PCR體系，程序，內(nèi)切酶和無引物PCR的程序等等。或者摸索重組條件的時候的依據(jù)有哪些？易錯PCR是將突變的堿基控制在一定的范圍之內(nèi)嗎，那不是沒摸索一次就要測一次序？ |
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cicelyzh
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【答案】應助回帖
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1949stone: 回帖置頂 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
1949stone: 回帖置頂 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
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1、 DH5a是一種常用于質(zhì)�？寺〉木辍.coli DH5a在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時，可與載體編碼的β－半乳糖苷酶氨基端實現(xiàn)α－互補。可用于藍白斑篩選鑒別重組菌株。JM109菌株在使用pUC系列質(zhì)粒載體進行DNA轉(zhuǎn)化或用M13 phage載體進行轉(zhuǎn)染時，由于載體DNA產(chǎn)生的LacZa多肽和JM09編碼的LacZΔM15進行α－互補，從而顯示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鑒別重組體菌株。 2、嚴格來說，藍白斑篩選還是要做的，篩選出白班之后再做PCR驗證，這樣假陽性概率就小。 3、選擇酶切位點很重要，不光要切下來，下一步還要能連接上去，查閱文獻是對的，好好篩選，挑選常見的，經(jīng)濟的，連接效率高的。 |
3樓2012-09-28 11:12:46
5樓2012-10-02 22:54:53
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