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zhangpamela木蟲 (小有名氣)
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[求助]
酶的分離純化
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| 我要純化一種從細菌提取出來的未知粗酶，鹽析后上離子交換，等電點未知，我準備選用DEAE-sephroseFF 填料試一試，但不知道選什么緩沖液，pH調(diào)為多少？不知道這種填料合適不？100ml的填料能用幾次？還挺貴的，一般這種未知的是首選陰離子呢還是陽離子？ |
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【答案】應(yīng)助回帖
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scelab: 金幣+5, MicEPI+1, good 2012-10-20 17:16:48
zhangpamela: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-11-26 16:18:50
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zhangpamela: 金幣+1, ★★★很有幫助 2012-11-26 16:18:50
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該酶的其他性質(zhì)知道嗎？ 選擇離子交換一般需要注意幾個問題： 1. 電導(dǎo)，即鹽濃度。本例中，你的樣品經(jīng)過了鹽析有可能鹽濃度較高，可能會影響層析； 2. 一般使用中性pH值，最好選取兩個點，比如7.0和8.0進行測試，這樣可以根據(jù)測試的電泳結(jié)果來判斷目的蛋白結(jié)合的趨勢； 3. 一般而言，可以先試陰離子交換，最好陰、陽離子能同時測試。 后續(xù)的實驗設(shè)計需要在前期的測試基礎(chǔ)進行。 |
2樓2012-10-20 09:10:16
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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先做粗酶液pH穩(wěn)定性的實驗，確定了穩(wěn)定范圍之后再選擇層析柱。 Effect of pH and temperature on glucoamylase activity and stability The effect of pH on glucoamylase activity is measuring glucoamylase activity at different pH value of pH 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 at 37ºC. The effect of temperature on glucoamylase activity is measuring glucoamylase activity at different temperature of 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 and 60ºC at optimum pH. The effect of pH on glucoamylase stability was conducted by mixing 0.1mL enzyme with 0.9mL 0.1M buffer in different pH value (The buffers used were: citrate-phosphate buffer, pH 3.0–7.0; sodium-phosphate buffer, pH 6.0–8.0; Tris-HCl buffer, pH 7.0–9.0; and glycine-NaOH buffer, pH 8.5–12.0). The mixtures were incubated at 4ºCfor 24h, and the residue enzyme activity were measured. The effect of temperature on enzyme stability was conducted by incubating enzyme at 30, 35, 40, 45, and 50ºC for 1 h, and the residue enzyme activity were measured. Each result of the character assay was showed by a scatter diagram with trend line, the highest activity was defined as 100%, other activity was defined as relative activity. The error bars represent the standard deviation of triplicate measurements. |
3樓2012-10-20 15:42:34
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4樓2012-10-20 15:46:44
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