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tulip1213銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR退火時(shí)間選擇
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最近做菌液PCR，鑒定克��；之前我退火時(shí)間總是選擇在30秒，今天用了1min，結(jié)果引物二聚體很亮，連非特異性條帶都沒有。 退火時(shí)間30秒還是一分鐘合適？ |
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銀蟲 (小有名氣)
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2樓2012-11-09 16:14:23
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【答案】應(yīng)助回帖
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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2012-11-10 15:34:08
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| 引物二聚體很亮，你應(yīng)該多考慮其他因素，引物本身，pcr結(jié)束后是否在室溫放置太長時(shí)間，引物量過大 or 模板濃度過小等，也可以取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時(shí)冷卻，這時(shí)再加入反應(yīng)體系當(dāng)中，引物二聚體就會消失的，也有人通過95°預(yù)變性5分鐘據(jù)說效果也可以。。。你說的那個(gè)延長退火時(shí)間，我也看到過類似的說法，能減少二聚體。。沒試過，但我覺得畢竟不是主要原因把，把其他方面做好，應(yīng)該就沒問題啦 |
3樓2012-11-09 16:44:49
4樓2012-11-09 16:56:14
ziwen120717
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6樓2012-11-09 21:35:06
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10樓2012-11-11 11:09:33
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