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tulip1213銀蟲 (小有名氣)
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[求助]
PCR退火時間選擇
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最近做菌液PCR，鑒定克��；之前我退火時間總是選擇在30秒，今天用了1min，結(jié)果引物二聚體很亮，連非特異性條帶都沒有。 退火時間30秒還是一分鐘合適？ |
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sc5921041
木蟲 (著名寫手)
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9樓2012-11-11 00:17:18
448935271
銀蟲 (小有名氣)
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2樓2012-11-09 16:14:23
【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-11-10 15:34:08
感謝參與，應助指數(shù) +1
小丹木木: 金幣+3, 鼓勵應助 2012-11-10 15:34:08
| 引物二聚體很亮，你應該多考慮其他因素，引物本身，pcr結(jié)束后是否在室溫放置太長時間，引物量過大 or 模板濃度過小等，也可以取你所要加的上下游引物混合后，在100攝氏度下的沸水中煮5分鐘，然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻，這時再加入反應體系當中，引物二聚體就會消失的，也有人通過95°預變性5分鐘據(jù)說效果也可以。。。你說的那個延長退火時間，我也看到過類似的說法，能減少二聚體。。沒試過，但我覺得畢竟不是主要原因把，把其他方面做好，應該就沒問題啦 |
3樓2012-11-09 16:44:49
4樓2012-11-09 16:56:14
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