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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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細(xì)菌膜蛋白提取后復(fù)溶？
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各位蟲友，我提取的是G-細(xì)菌膜蛋白，用的是超速離心的方法，具體如下： 1. 100ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液，離心洗滌，后2ml生理鹽水重懸； 2. 超聲破碎后，5000g,20min去除未破壁細(xì)胞； 3. 100,000g,4度離心1h； 4. 沉淀用3ml含2%SLS的生理鹽水重懸，室溫放置30min后用槍頭輕輕吹打使之溶解；100,000g,4度離心1h； 5. 重復(fù)步驟4一次； 6. 用200ul蒸餾水溶解沉淀。 結(jié)果加入蒸餾水后沉淀不能溶液，過(guò)夜也不行，加入了2%SDS后，50度復(fù)溶也不行。試了2%triton-100也不行。 請(qǐng)問(wèn)，有遇到這種情況的嗎，怎么解決��？ 謝謝了  |
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zhangxingc: 金幣+4, 鼓勵(lì)新蟲發(fā)帖，歡迎常到微生物版 2013-05-02 14:23:33
zhangxingc: 金幣+4, 鼓勵(lì)新蟲發(fā)帖，歡迎常到微生物版 2013-05-02 14:23:33
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您好！您的問(wèn)題現(xiàn)在解決了嗎？ 我目前也是在做G-的膜蛋白提取，也用的是超離的方法，加的SLS也是2%的孵育半小時(shí)，提取過(guò)后跑電泳，提取材料用的是-20℃的菌體時(shí)一直跑不出電泳條帶，用新鮮菌液做的時(shí)候就有條帶過(guò)，很費(fèi)解啊…………由于現(xiàn)實(shí)原因我的實(shí)驗(yàn)材料只有-20℃冷凍保藏的菌體，無(wú)法新鮮培養(yǎng)，一直沒(méi)有進(jìn)展，求大師指點(diǎn)��！ 對(duì)了，我是用的tris-HCl（pH=7.5）溶解的蛋白。 |
2樓2013-05-02 09:07:52
youngsun50
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我的操作過(guò)程： 100ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌，經(jīng)離心收集，并用Tris-Mg 緩沖液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM MgCl2]洗滌，后重懸于3ml Tris-Mg 緩沖液中。冰浴超聲破碎菌體，6000g，10min離心收集上清液，棄去未破碎細(xì)菌，上清液4 ℃ 100,000g 離心lh，收集沉淀。用5ml含2％的十二烷基肌氨酸鈉（SLS）的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min，100,000g 室溫離心lh，收集沉淀，重復(fù)該步驟一次，最后得到的沉淀（即為外膜蛋白）用100~200ul TES緩沖液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM乙二胺四乙酸（EDTA）, 2%十二烷基磺酸鈉（SDS）]溶解。 TES溶解蛋白效果好一些，但凍存復(fù)溶時(shí)還是有沉淀，但我覺(jué)得對(duì)定性沒(méi)影響。對(duì)于你的冷凍菌體提取，我一般也收集完菌體，凍與-20或-70，第二天再進(jìn)行下一步，沒(méi)啥影響。不知凍的時(shí)間長(zhǎng)了對(duì)外膜蛋白分離有啥影響？ |
3樓2013-05-03 16:40:38
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4樓2013-05-04 11:20:57
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5樓2013-05-04 11:58:16
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