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youngsun50木蟲 (正式寫手)
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[求助]
細菌膜蛋白提取后復(fù)溶？
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各位蟲友，我提取的是G-細菌膜蛋白，用的是超速離心的方法，具體如下： 1. 100ml過夜培養(yǎng)菌液，離心洗滌，后2ml生理鹽水重懸； 2. 超聲破碎后，5000g,20min去除未破壁細胞； 3. 100,000g,4度離心1h； 4. 沉淀用3ml含2%SLS的生理鹽水重懸，室溫放置30min后用槍頭輕輕吹打使之溶解；100,000g,4度離心1h； 5. 重復(fù)步驟4一次； 6. 用200ul蒸餾水溶解沉淀。 結(jié)果加入蒸餾水后沉淀不能溶液，過夜也不行，加入了2%SDS后，50度復(fù)溶也不行。試了2%triton-100也不行。 請問，有遇到這種情況的嗎，怎么解決�。� 謝謝了  |
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我的操作過程： 100ml過夜培養(yǎng)的細菌，經(jīng)離心收集，并用Tris-Mg 緩沖液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM MgCl2]洗滌，后重懸于3ml Tris-Mg 緩沖液中。冰浴超聲破碎菌體，6000g，10min離心收集上清液，棄去未破碎細菌，上清液4 ℃ 100,000g 離心lh，收集沉淀。用5ml含2％的十二烷基肌氨酸鈉（SLS）的Tris-Mg 緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min，100,000g 室溫離心lh，收集沉淀，重復(fù)該步驟一次，最后得到的沉淀（即為外膜蛋白）用100~200ul TES緩沖液[10mM Tris-Cl (pH 7.3)，5mM乙二胺四乙酸（EDTA）, 2%十二烷基磺酸鈉（SDS）]溶解。 TES溶解蛋白效果好一些，但凍存復(fù)溶時還是有沉淀，但我覺得對定性沒影響。對于你的冷凍菌體提取，我一般也收集完菌體，凍與-20或-70，第二天再進行下一步，沒啥影響。不知凍的時間長了對外膜蛋白分離有啥影響？ |
3樓2013-05-03 16:40:38
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4樓2013-05-04 11:20:57
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5樓2013-05-04 11:58:16
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