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[求助] PCR退火溫度

PCR退火溫度，試了50，55，60度，都沒(méi)有擴(kuò)增出來(lái)，怎么回事，接下來(lái)該怎么做啊？求大師指點(diǎn)。

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要么好好活，要么死，拒絕半死不活

1樓 2012-12-21 11:21:43

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dongrh1981

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amisking: 回帖置頂 2012-12-22 19:41:26
fanwq258: 金幣+1 2012-12-30 21:56:13

首先，確認(rèn)你所用的試劑是哪些廠家的，有沒(méi)有問(wèn)題？
其次，你提取的核酸是否OK，濃度和純度能不能達(dá)到PCR要求？
最后，在做PCR時(shí)，帶一個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控，用于判斷你的PCR試劑和PCR條件是否有問(wèn)題。
一般來(lái)說(shuō)引物長(zhǎng)度在24bp左右時(shí)，退火溫度55度左右應(yīng)該是可以做出來(lái)的，所以建議你多考慮下前面的準(zhǔn)備工作是否OK。
最好是將你的實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行詳細(xì)描述，否則無(wú)法判斷具體原因

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呼吸的痛

2樓2012-12-21 11:41:58

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platanus

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跑一個(gè)梯度PCR試試看，有些引物對(duì)退火溫度還是比較敏感的，一兩度之間差異很大的。

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3樓2012-12-21 11:42:40

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loveskyzhou

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樓上兩位說(shuō)的都很好，結(jié)合到一起吧，touchdown挺好的，如果引物沒(méi)問(wèn)題一般都能P出?懟Ｒ餀z查的時(shí)候注意GC含量，過(guò)大的話可以嘗試用特殊的LA酶

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我會(huì)繞一個(gè)圈，走回到實(shí)驗(yàn)室

4樓2012-12-21 13:50:17

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tanxi125

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跑個(gè)內(nèi)參看看，內(nèi)參一般都會(huì)跑出來(lái)，如果跑出來(lái)起碼確定體系和模板沒(méi)問(wèn)題

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什么都得靠自己！我現(xiàn)在深刻理解！

5樓2012-12-21 15:49:03

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czcpudai

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不知道你擴(kuò)增的片段是多大？要是超過(guò)1kb的話，建議使用好的酶，比如Primestar，我覺(jué)得你的PCR問(wèn)題不是出現(xiàn)在退火溫度上，引物你都做了梯度了還是沒(méi)有，建議換好的高保真酶！

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6樓2012-12-21 16:36:40

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reallpf

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提高引物特異性，采用touch-down PCR。

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7樓2012-12-21 16:52:01

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具體信息發(fā)過(guò)來(lái)，引物，片段長(zhǎng)度試劑體系等等

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8樓2012-12-21 21:54:51

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8樓: Originally posted by wangqi20092 at 2012-12-21 21:54:51
具體信息發(fā)過(guò)來(lái)，引物，片段長(zhǎng)度試劑體系等等

模版是mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，要擴(kuò)增的片段1040bp，試劑是TAKARA的mix。20ul的體系中模版1ul，引物各0.8ul，mix 10ul。引物Tm值分別是64，57。

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9樓2012-12-21 22:16:59

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2樓: Originally posted by dongrh1981 at 2012-12-21 11:41:58
首先，確認(rèn)你所用的試劑是哪些廠家的，有沒(méi)有問(wèn)題？
其次，你提取的核酸是否OK，濃度和純度能不能達(dá)到PCR要求？
最后，在做PCR時(shí)，帶一個(gè)陰性質(zhì)控和一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控，用于判斷你的PCR試劑和PCR條件是否有問(wèn)題。
一般 ...

模版是mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，要擴(kuò)增的片段1040bp，試劑是TAKARA的mix。20ul的體系中模版1ul，引物各0.8ul，mix 10ul。引物Tm值分別是64，57。

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10樓2012-12-21 22:18:45

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