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新蟲(chóng) (初入文壇)

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[求助] 目的片段丟了一截

求指教，最近做TA克隆，目的基因和T載體連好后轉(zhuǎn)化，挑單克隆提質(zhì)粒，可是目的基因丟了好大一段，變小了，有蟲(chóng)友遇到相同問(wèn)題嗎，怎么解決的呢？

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1樓 2012-12-27 17:10:29

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Arrennew

鐵桿木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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【答案】應(yīng)助回帖

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1. 質(zhì)粒是超螺旋，不切開(kāi)電泳看不出確切的分子量，和Marker比是沒(méi)有意義的
2. 建議測(cè)序后再說(shuō)少?zèng)]少，如果的確少了，最有可能的情況是一條引物的末端有重復(fù)序列，測(cè)序后自然就知道了，解決方法是把引物加長(zhǎng)，用高退火重新擴(kuò)。

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生命不息，探索不止。

8樓2012-12-30 12:18:10

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Lester11

銀蟲(chóng) (小有名氣)

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【答案】應(yīng)助回帖

★ ★
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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)交流 2012-12-28 17:25:43

這個(gè)問(wèn)題我們實(shí)驗(yàn)室的一位師兄遇到過(guò)，挺麻煩的。
你看一看你的目的基因是不是有部分GC含量很高，這樣的話PCR可能就跳過(guò)了那一部分，P出來(lái)的基因少一片斷。
遇到這種情況你要換一種更有效的針對(duì)高GC的內(nèi)切酶。
試試看吧，這種問(wèn)題比較常見(jiàn)，多嘗試，也是一個(gè)成長(zhǎng)的過(guò)程。

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2樓2012-12-27 19:29:22

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gyesang

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【答案】應(yīng)助回帖

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看看丟掉的那一段是不是重復(fù)序列

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3樓2012-12-27 20:53:13

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zyqdyk

木蟲(chóng) (正式寫(xiě)手)

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小丹木木: 金幣+2, 股鼓勵(lì)交流 2012-12-28 17:25:56

目的基因少了一段是指菌落PCR結(jié)果還是測(cè)序結(jié)果？
如果菌落PCR結(jié)果有可能你用的T載體的通用引物與基因上的一段序列相同或類似，再有可能染菌。
如果是測(cè)序結(jié)果得到的只是一段我就不是很明白了，個(gè)人認(rèn)為這種情況一般不會(huì)出現(xiàn)。

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4樓2012-12-28 11:17:14

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