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nalanyuhang

新蟲 (初入文壇)

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專業(yè): 腫瘤病因

[求助] western blot p-erk

最近實驗要做western blot 測erk、p-erk加藥后含量變化。
實驗室用的RIPA裂解液配方為：50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mMEDTA、1% TritonX-100、1%脫氧膽酸鈉、0.1% SDS。蛋白酶抑制劑用的是PMSF，現(xiàn)在想問一下有沒有做過類似實驗的幫我看一下配方能提出我想要的蛋白嗎？是不是還應(yīng)該加磷酸酶抑制劑？是的話應(yīng)該加什么物質(zhì)，濃度是多少？還有就是我是western新手，測磷酸化蛋白有沒有什么注意事項啊，希望有做過的戰(zhàn)友幫忙分享點寶貴經(jīng)驗，感激不盡！

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原創(chuàng)首發(fā)：Tips for Western Blot-一些小技巧而已已經(jīng)有13人回復(fù)

孝文要加油

1樓 2013-01-10 18:05:32

已閱回復(fù)此樓關(guān)注TA 給TA發(fā)消息送TA紅花 TA的回帖

porphybaby

金蟲 (正式寫手)

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【答案】應(yīng)助回帖

感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1

PMSF可能不足以抑制所有蛋白酶的活性。

建議你去買一個羅氏的產(chǎn)品叫 Roche complete，Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free. 具體什么名字我忘了。
它是一種混合片劑，可以溶在裂解中，抑制多種蛋白酶的活性。

好像現(xiàn)在出了一款升級版，里頭就加了磷酸酶抑制劑的。但這種cocktail 藥片比較貴，你可以問問那些代理公司有沒有散裝的賣。

然后你注意在樣品處理的時候要冰浴，一定要在冰上進(jìn)行，保持低溫。還有

贊一下

回復(fù)此樓

2樓2013-01-10 18:50:39

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