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高照李木蟲 (正式寫手)
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[求助]
昆蟲基因PCR后電泳條帶淡，急求幫助？？？？
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我在做幾種昆蟲的DNA線粒體DNA COI片段，目的基因大小約600-700bp,用pcr擴增COI片段，50μl的擴增反應(yīng)體系是： Premix Ex Taq 25μl 引物1（LCO1490)（10μM）2μl 引物2 (HCO2198)（10μM）2μl 模板1μl（<50ng）1~4μ不等，濃度在150~300ng/ul。 加水至50ul。 PCR反應(yīng)程序：95度10min。94℃預(yù)變性3min，94℃變性60s，44℃退火60s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后，72℃延伸10min。 圖中顯示有的條帶太暗了而且有的有彌散，引物正常。做過退火溫度的梯度實驗，有出來的條帶但很淡。今晚做的條帶更淡且有彌散。請問我該怎么調(diào)？ 另外昨天做實驗時水加少了，結(jié)果有的種類出來了，請問是預(yù)混酶濃度變化的問題嗎？不知道哪位高人能幫幫分析一下？ 未標題-2.jpg |
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