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[求助] RNA 提取如何保證質(zhì)量已有1人參與

最近在反復(fù)提取細(xì)胞RNA,但是提取出來(lái)的RNA A260/280和A260/230都在(2.0-2.1)這個(gè)范圍，各位大神們給點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，幫幫我吧

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一手生存，一手夢(mèng)想

1樓 2013-02-28 09:53:52

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bioluke

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小丹木木: 金幣+3, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-03-01 13:43:07

如果用的是trizol法，一開(kāi)始的研磨要盡量破碎，建議液氮+超聲波一起用；取上清的時(shí)候接近白層部分不要（寧缺毋濫）；留下白色沉淀與管底壁后，再短暫離心吸除管壁剩余上清；OD值在1.8-2.0均可，你這個(gè)范圍說(shuō)明RNA有降解，可能是沒(méi)用低溫離心機(jī)造成的（也可能細(xì)胞本身時(shí)間過(guò)長(zhǎng)降解）？如果用的是試劑盒法，那也是類似的在研磨和去上清步驟中要注意。另外一般來(lái)說(shuō)OD值只是參考，跑膠才更準(zhǔn)確些。祝你成功

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4樓2013-02-28 15:33:24

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追夢(mèng)的人1987

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看吸光度，雜質(zhì)好像有點(diǎn)多，你能上個(gè)膠圖看看嗎

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2樓2013-02-28 10:41:06

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肖嘉毅

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小丹木木: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助 2013-03-01 13:42:50

你是用Trizol提取的嗎？細(xì)胞的RNA很好提取的，最好用Trizol直接將細(xì)胞裂解下來(lái)。至于OD比值只是個(gè)參考，RNA最理想的不是2.0嗎，我之前提組織RNA OD比值在1.65左右時(shí)跑膠也能看到挺好的結(jié)果，RNA提完后跑膠是最好的檢測(cè)方式。

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3樓2013-02-28 14:41:38

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lidonghong

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提取的RNA看質(zhì)量最好的方法不是測(cè)OD值，而是跑膠觀察，建議你跑個(gè)膠看看，另外提取RNA時(shí)要注意各種器具的滅酶處理，另外實(shí)驗(yàn)過(guò)程勤換手套。

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生物化學(xué)與分子生物學(xué)

5樓2013-02-28 16:37:43

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scilencing

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RNA提取過(guò)程有許多細(xì)節(jié)問(wèn)題需注意：
1、提取過(guò)程所用的EP管、移液頭都需要用DEPC水進(jìn)行處理、干燥、高溫高壓滅菌。
2、提取操作最好在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行，需要配帶一次手套，而且手套不能多次重復(fù)使用。
3、在分離兩相液體時(shí)，注意操作輕柔、勻速，兩相間的界面，吸取液體不能混有臨界層。

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6樓2013-03-01 10:58:25

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2樓: Originally posted by 追夢(mèng)的人1987 at 2013-02-28 10:41:06
看吸光度，雜質(zhì)好像有點(diǎn)多，你能上個(gè)膠圖看看嗎

跑了膠，出來(lái)三條帶，貌似效果還可以；
就是嫌那個(gè)A260/A280有點(diǎn)高

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一手生存，一手夢(mèng)想

7樓2013-03-01 12:21:18

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3樓: Originally posted by 肖嘉毅 at 2013-02-28 14:41:38
你是用Trizol提取的嗎？細(xì)胞的RNA很好提取的，最好用Trizol直接將細(xì)胞裂解下來(lái)。至于OD比值只是個(gè)參考，RNA最理想的不是2.0嗎，我之前提組織RNA OD比值在1.65左右時(shí)跑膠也能看到挺好的結(jié)果，RNA提完后跑膠是最好的檢 ...

嗯，直接裂解，都沒(méi)有在冰上操作，
我想我找到原因了：加氯仿后，吸取的時(shí)候我直接用1ml的槍頭吸取的，下次要換200ul的吸取

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8樓2013-03-01 12:29:05

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4樓: Originally posted by bioluke at 2013-02-28 15:33:24
如果用的是trizol法，一開(kāi)始的研磨要盡量破碎，建議液氮+超聲波一起用；取上清的時(shí)候接近白層部分不要（寧缺毋濫）；留下白色沉淀與管底壁后，再短暫離心吸除管壁剩余上清；OD值在1.8-2.0均可，你這個(gè)范圍說(shuō)明RNA有 ...

嗯，提取時(shí)間有點(diǎn)長(zhǎng)，下次要加快速度

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9樓2013-03-01 12:29:47

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5樓: Originally posted by lidonghong at 2013-02-28 16:37:43
提取的RNA看質(zhì)量最好的方法不是測(cè)OD值，而是跑膠觀察，建議你跑個(gè)膠看看，另外提取RNA時(shí)要注意各種器具的滅酶處理，另外實(shí)驗(yàn)過(guò)程勤換手套。

先測(cè)了OD，然后再跑膠；
1ulRNA+4ulDEPC WATER+ 1ul 6* loading buffer

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10樓2013-03-01 12:31:01

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