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guyue900905新蟲 (初入文壇)
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[求助]
什么樣地結(jié)果算是pcr后p出來(lái)了，謝謝~~~~~
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| 我提取的動(dòng)物肌肉組織rna，od值略大，但是師姐說(shuō)只要PCR能P出來(lái)就可以了。我想問一下各位高手，什么樣算是P出來(lái)了啊？謝謝。順便問一下普通pcr的條件和實(shí)時(shí)熒光定量pcr條件一樣么？謝謝 |
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【答案】應(yīng)助回帖
感謝參與，應(yīng)助指數(shù) +1
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首先，如果OD值偏大，PCR的時(shí)候有可能是擴(kuò)的是基因組的片段，所以設(shè)計(jì)引物的時(shí)候最好是跨著內(nèi)含子設(shè)計(jì)，這樣估計(jì)就像你師姐說(shuō)的，PCR能P出來(lái)就可以了； 其次，能P出來(lái)的就是說(shuō)除了引物二聚體的條帶外，你所擴(kuò)增的目的片段的大小，跟你設(shè)計(jì)引物時(shí)的片段大小基本相同，不能太大也不能太小，否則很可能是非特異性擴(kuò)增或者其他的情況，這種得到的片段一般都不是你想要的； 最后，實(shí)時(shí)熒光定量的條件一般是固定的，跟熒光定量的試劑有關(guān)，一般與普通PCR的條件是不一樣的，熒光定量的條件在試劑說(shuō)明書上都有，包括PCR的組分和各階段的反應(yīng)時(shí)間，基本按照那個(gè)上面的做就沒有問題 做熒光定量的實(shí)驗(yàn)，最好是把RNA提的質(zhì)量高一點(diǎn)，這樣后期做也比較順暢，其實(shí)不是很難，入門以后就簡(jiǎn)單了，好好做，加油！  |
2樓2013-03-05 11:03:56
yesali
木蟲 (正式寫手)
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3樓2013-03-05 12:08:22
guyue900905
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4樓2013-03-05 15:27:56
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5樓2013-03-05 15:30:37
6樓2013-03-07 23:19:02
【答案】應(yīng)助回帖
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標(biāo)準(zhǔn)曲線都是先做的吧，不然你拿什么做對(duì)照，你怎么定出目的基因表達(dá)的量 ��？我沒做絕對(duì)定量，我做的是相對(duì)的，只是比較動(dòng)物個(gè)組織中表達(dá)的差異，并沒有做出具體有多少量，我?guī)熃阌玫臉?biāo)準(zhǔn)曲線法做的。你用標(biāo)準(zhǔn)曲線法的話先做標(biāo)準(zhǔn)曲線吧，雖然麻煩點(diǎn)，不過結(jié)果需要。 我們一般都放-80度，可以放很久，不知道影不影響質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄完了也沒多久就用完了，一個(gè)月左右吧也就，-20度不太清楚，沒放過 |
7樓2013-03-07 23:24:48
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