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履霜木蟲 (正式寫手)
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[求助]
PCR產(chǎn)物不做純化和膠回收，直接TA克隆可以嗎？
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如題， 我做的巢式PCR，跑膠之后亮度很好，沒(méi)有雜帶。Taq酶里面預(yù)混有染料，我能不能直接連載體做克隆，用pMD18？手邊沒(méi)有膠回收試劑盒啊。 |
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4樓2013-03-06 11:19:28
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小丹木木: 金幣+3, 專家考核, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn)，呵呵 2013-03-06 17:18:16
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小丹木木: 金幣+3, 專家考核, 鼓勵(lì)交流經(jīng)驗(yàn)，呵呵 2013-03-06 17:18:16
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不可，影響下面的酶切酶連活性 涉及酶的操作都不要疏忽，酶對(duì)反應(yīng)條件相應(yīng)要求較高， pcr體系里，看著澄清透明，看不見(jiàn)的是pH值，鹽離子濃度，都會(huì)給內(nèi)切酶帶來(lái)麻煩。 當(dāng)然不排除有很小幾率做出后續(xù)試驗(yàn)（本人師兄拿自來(lái)水都能提出RNA來(lái)，嘆服），理論上一定要回收的 |
3樓2013-03-05 15:53:17
beer胖
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5樓2013-03-07 21:52:06
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沒(méi)有目的條帶，顯然是沒(méi)有轉(zhuǎn)化進(jìn)去 沒(méi)有藍(lán)白斑比較可疑，實(shí)際上應(yīng)該說(shuō)都是白斑，沒(méi)有藍(lán)斑吧？板子放4℃容易顯藍(lán)斑 如果你pcr出來(lái)，沒(méi)有藍(lán)斑，可能是x-gal出問(wèn)題了 但是你pcr都沒(méi)出來(lái)，那就重做連接，加大目的片段與載體的比例 最重要的是加入一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)照，確保轉(zhuǎn)化、篩選過(guò)程沒(méi)有問(wèn)題 |
9樓2013-03-27 13:33:34
2樓2013-03-05 14:58:43
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做TA克隆時(shí)，直接用PCR產(chǎn)物跟pMD18載體連接，我的PCR產(chǎn)物結(jié)果較好，目標(biāo)片段長(zhǎng)度263bp，電泳時(shí)看不出非特異擴(kuò)增，有引物二聚體。 克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固體培養(yǎng)基平板篩選，看不到藍(lán)白班，但有許多單菌落，挑單菌落于含1ml LB液體培養(yǎng)基的試管中搖菌10小時(shí)，用菌液PCR檢測(cè)（所用引物于前面pcr的引物相同，反映條件也相同，只是94度預(yù)變性時(shí)間改為10分鐘）。但是檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有目的條帶，只有100bp左右的引物二聚體。 想問(wèn)問(wèn)您，這是什么原因？ 非常謝謝！ |
6樓2013-03-27 13:23:02
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做TA克隆時(shí)，直接用PCR產(chǎn)物跟pMD18載體連接，我的PCR產(chǎn)物結(jié)果較好，目標(biāo)片段長(zhǎng)度263bp，電泳時(shí)看不出非特異擴(kuò)增，有引物二聚體。 克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固體培養(yǎng)基平板篩選，看不到藍(lán)白班，但有許多單菌落，挑單菌落于含1ml LB液體培養(yǎng)基的試管中搖菌10小時(shí)，用菌液PCR檢測(cè)（所用引物于前面pcr的引物相同，反映條件也相同，只是94度預(yù)變性時(shí)間改為10分鐘）。但是檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有目的條帶，只有100bp左右的引物二聚體。 想問(wèn)問(wèn)您，這是什么原因？ |
7樓2013-03-27 13:23:44
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做TA克隆時(shí)，直接用PCR產(chǎn)物跟pMD18載體連接，我的PCR產(chǎn)物結(jié)果較好，目標(biāo)片段長(zhǎng)度263bp，電泳時(shí)看不出非特異擴(kuò)增，有引物二聚體。 克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固體培養(yǎng)基平板篩選，看不到藍(lán)白班，但有許多單菌落，挑單菌落于含1ml LB液體培養(yǎng)基的試管中搖菌10小時(shí)，用菌液PCR檢測(cè)（所用引物于前面pcr的引物相同，反映條件也相同，只是94度預(yù)變性時(shí)間改為10分鐘）。但是檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有目的條帶，只有100bp左右的引物二聚體。 想問(wèn)問(wèn)您，這是什么原因？ |
8樓2013-03-27 13:23:57
10樓2013-03-27 15:45:20
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