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小木蟲論壇-學術科研互動平臺 » 生物醫(yī)藥區(qū) » 分子生物 » 綜合其他 » 從頭設計引物克隆全長基因
| 查看: 2746 | 回復: 22 | ||
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從頭設計引物克隆全長基因
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| 我的序列是未知的，我先做了保守區(qū)克隆+3'race+5'race，然后將他們拼接起來，去掉屬于質粒和RACE試劑盒的區(qū)段，得到拼接序列。我現在想從頭設計引物來克隆這個序列。驗證一下拼接結果。5'端引物打分還行，3'端結尾打分都比較低。并且還有個POLY A尾十幾個A。有這方面經驗的蟲友指點我下，該怎么做呢。謝謝。 |
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6樓2013-03-08 09:17:24
niil
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只要你得到了全長cDNA，ORF是很好預測的。 NCBI有在線的預測工具ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 并且用blastx做一下比對，ORF是很容易確定的。 |
8樓2013-03-08 09:32:17
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10樓2013-03-08 10:23:38
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12樓2013-03-11 09:40:29
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18樓2013-03-14 12:52:24
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2樓2013-03-07 10:50:05
3樓2013-03-07 11:40:05
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【答案】應助回帖
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fengyunqb: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-08 09:18:27
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fengyunqb: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2013-04-22 16:24:30
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那這樣的話，在ORF兩端設計引物，就是擴起始密碼和終止密碼之間的片段就行。 引物的位置不用嚴格限定位于這兩個位點，能在ORF外側設計引物最好，要是在ORF內側設計引物，與起始密碼和終止密碼差個10-20bp沒有問題，引物稍微長一點，把這個片段克隆出來之后，再進行表達載體構建，這時候把缺失的堿基通過引物設計的方法補上在以克隆出來的片段為模板獲得完整的ORF。 引物設計軟件的得分雖然是衡量標準，但是得分低并不是意味著這個片段擴不出來。尤其是定點設計引物的時候，有矛盾也只能退而求次了。 |
4樓2013-03-07 12:02:45
5樓2013-03-08 09:04:01
7樓2013-03-08 09:18:17
9樓2013-03-08 09:56:21
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