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[求助]
從頭設(shè)計引物克隆全長基因
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| 我的序列是未知的，我先做了保守區(qū)克隆+3'race+5'race，然后將他們拼接起來，去掉屬于質(zhì)粒和RACE試劑盒的區(qū)段，得到拼接序列。我現(xiàn)在想從頭設(shè)計引物來克隆這個序列。驗證一下拼接結(jié)果。5'端引物打分還行，3'端結(jié)尾打分都比較低。并且還有個POLY A尾十幾個A。有這方面經(jīng)驗的蟲友指點我下，該怎么做呢。謝謝。 |
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6樓2013-03-08 09:17:24
niil
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只要你得到了全長cDNA，ORF是很好預(yù)測的。 NCBI有在線的預(yù)測工具ORF finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html） 并且用blastx做一下比對，ORF是很容易確定的。 |
8樓2013-03-08 09:32:17
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10樓2013-03-08 10:23:38
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12樓2013-03-11 09:40:29
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18樓2013-03-14 12:52:24
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2樓2013-03-07 10:50:05
3樓2013-03-07 11:40:05
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【答案】應(yīng)助回帖
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fengyunqb: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-08 09:18:27
fengyunqb: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2013-04-22 16:24:30
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那這樣的話，在ORF兩端設(shè)計引物，就是擴(kuò)起始密碼和終止密碼之間的片段就行。 引物的位置不用嚴(yán)格限定位于這兩個位點，能在ORF外側(cè)設(shè)計引物最好，要是在ORF內(nèi)側(cè)設(shè)計引物，與起始密碼和終止密碼差個10-20bp沒有問題，引物稍微長一點，把這個片段克隆出來之后，再進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建，這時候把缺失的堿基通過引物設(shè)計的方法補(bǔ)上在以克隆出來的片段為模板獲得完整的ORF。 引物設(shè)計軟件的得分雖然是衡量標(biāo)準(zhǔn)，但是得分低并不是意味著這個片段擴(kuò)不出來。尤其是定點設(shè)計引物的時候，有矛盾也只能退而求次了。 |
4樓2013-03-07 12:02:45
5樓2013-03-08 09:04:01
7樓2013-03-08 09:18:17
9樓2013-03-08 09:56:21
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