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[求助]
從頭設(shè)計(jì)引物克隆全長(zhǎng)基因
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| 我的序列是未知的，我先做了保守區(qū)克隆+3'race+5'race，然后將他們拼接起來(lái)，去掉屬于質(zhì)粒和RACE試劑盒的區(qū)段，得到拼接序列。我現(xiàn)在想從頭設(shè)計(jì)引物來(lái)克隆這個(gè)序列。驗(yàn)證一下拼接結(jié)果。5'端引物打分還行，3'端結(jié)尾打分都比較低。并且還有個(gè)POLY A尾十幾個(gè)A。有這方面經(jīng)驗(yàn)的蟲友指點(diǎn)我下，該怎么做呢。謝謝。 |
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niil
金蟲 (正式寫手)
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【答案】應(yīng)助回帖
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fengyunqb: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-08 09:18:27
fengyunqb: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2013-04-22 16:24:30
fengyunqb: 金幣+5, ★★★很有幫助 2013-03-08 09:18:27
fengyunqb: 金幣+10, ★★★★★最佳答案 2013-04-22 16:24:30
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那這樣的話，在ORF兩端設(shè)計(jì)引物，就是擴(kuò)起始密碼和終止密碼之間的片段就行。 引物的位置不用嚴(yán)格限定位于這兩個(gè)位點(diǎn)，能在ORF外側(cè)設(shè)計(jì)引物最好，要是在ORF內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)引物，與起始密碼和終止密碼差個(gè)10-20bp沒(méi)有問(wèn)題，引物稍微長(zhǎng)一點(diǎn)，把這個(gè)片段克隆出來(lái)之后，再進(jìn)行表達(dá)載體構(gòu)建，這時(shí)候把缺失的堿基通過(guò)引物設(shè)計(jì)的方法補(bǔ)上在以克隆出來(lái)的片段為模板獲得完整的ORF。 引物設(shè)計(jì)軟件的得分雖然是衡量標(biāo)準(zhǔn)，但是得分低并不是意味著這個(gè)片段擴(kuò)不出來(lái)。尤其是定點(diǎn)設(shè)計(jì)引物的時(shí)候，有矛盾也只能退而求次了。 |
4樓2013-03-07 12:02:45
niil
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2樓2013-03-07 10:50:05
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