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草山殘夢(mèng)新蟲 (小有名氣)
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請(qǐng)教實(shí)時(shí)熒光定量PCR的步驟
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| 請(qǐng)教實(shí)時(shí)熒光定量PCR的步驟，本小蟲預(yù)用熒光定量分析菌群動(dòng)態(tài)變化，可不知道操作起來具體步驟，該注意哪些問題？謝謝啦 |
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【答案】應(yīng)助回帖
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半定量和實(shí)時(shí)定量PCR步驟 實(shí)驗(yàn)原理： RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結(jié)合在一起，提供了一種分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對(duì)表達(dá)信息進(jìn)行檢測(cè)或定量。另外，這項(xiàng)技術(shù)還可以用來檢測(cè)基因表達(dá)差異或不必構(gòu)建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護(hù)分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。 RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可以使用逆轉(zhuǎn)錄酶，以隨機(jī)引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)步驟： Trizol法RNA提取步驟 1、提取總RNA 2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 3、PCR反應(yīng) 以下實(shí)驗(yàn)步驟僅供參考： 1 樣品RNA的抽提 ①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。 ②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。 ③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀�；靹蚝�，4℃下7000rpm離心5分鐘。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA質(zhì)量檢測(cè) 1）紫外吸收法測(cè)定 先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。 ① 濃度測(cè)定 A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml。具體計(jì)算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測(cè)得A260 = 0.21 RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用來測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②純度檢測(cè) RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。 2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定 ①制膠 1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS電泳緩沖液 濃度 成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸鈉 0.01M EDTA 灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。 ②準(zhǔn)備RNA樣品 取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。 ③電泳 上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。 ④紫外透射光下觀察并拍照 28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。 3樣品cDNA合成 ① 反應(yīng)體系 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl 5 逆轉(zhuǎn)錄MMLV 0.5μl 2 上游引物 0.2μl 6 DEPC水 5μl 3 下游引物 0.2μl 7 RNA模版 2μl 4 dNTP 0.1μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 ②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。 ③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。 4梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR ①β-actin陽性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋（加水27μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。 ② 反應(yīng)體系如下：標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 1μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 6 陽性模板DNA 5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 7 ddH2O 32.5μl 4 dNTP 0.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 管家基因反應(yīng)體系： 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 1μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 6 待測(cè)樣品cDNA 5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 7 ddH2O 32.5μl 4 dNTP 0.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 ③制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。 5 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板 ①針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 反應(yīng)體系： 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 10× PCR緩沖液 2.5 ul 5 dNTP混合液 3μl 2 MgCl2 溶液 1.5μl 6 Taq酶 1μl 3 上游引物F 0.5μl 7 cDNA 1μl 4 下游引物R 0.5μl 8 加水至總體積為 25μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 35個(gè)PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72oC延伸5分鐘。 ②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。 ③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。 6 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR ①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。 體系配置如下： 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 序號(hào) 反應(yīng)物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 5 Taq酶 2μl 2 上游引物F 1μl 6 待測(cè)樣品cDNA 5μl 3 下游引物R 1μl 7 ddH2O 30μl 4 dNTP 1μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。 ②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，最后72℃7分鐘延伸。 7 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表 引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。 PCR實(shí)驗(yàn)步驟 一、組織抽提： 1.取組織塊50-100㎎用液氮在研缽中研磨成粉末 2.移入玻璃勻漿器加入1ml Trizol 抽打勻漿 3.移入1.5ml新離心管用5 ml針頭抽打 4.冰上孵育5分鐘 5.離心12,000g 4℃ 5分鐘 取上清液移入1.5ml新離心管 6.加0.2 ml氯仿，震蕩，冰上孵育5分鐘 7.離心<12,000g 4℃ 10分鐘 取上層液相移入1.5ml新離心管 8. 加0.5 ml異丙醇，震蕩，冰上孵育5分鐘 9.離心<12,000g 4℃ 5分鐘 棄去上清液 10.加入1 ml 75%乙醇，震蕩 11. 離心<7,500g, 4℃,5分鐘 棄去上清液 12.室溫下使之變透明 13.加入DEPC處理水10μl --35μl 溶解RNA（ 可保存在液氮或低溫冰箱） 14.走RNA變性電泳觀察18s，28s條帶，分光光度計(jì)檢測(cè)260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度 二、RT反應(yīng)體系 RT反應(yīng)體系（第一步）：約20分鐘 RNA抽提物 5μl Radome 引物 2μl RNA sin 0.5μl 1. 65℃ 15分鐘 2. 立即放入冰浴 RT反應(yīng)體系（第二步）：約2小時(shí) RNA sin 0.5μl 10mM dNTP 1μl 5×RT 緩沖液 4μl 25mM MgCl2 4μl AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 3μl 1. 37℃ 1.5小時(shí) 2. 94℃ 5-10分鐘 3.反應(yīng)物保存于-20℃或進(jìn)行PCR 三PCR反應(yīng)體系 1)、PCR反應(yīng)體系：約4.5小時(shí) 25mM MgCl2 2μl 10×PCR 緩沖液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 2.5μl ddH2O 34μl Taq酶 0.5μl 輕質(zhì)石蠟油 50μl 100μl 1.94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘 為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán) 2.94℃ 45秒，55℃ 40秒，72℃ 1分鐘 為第二步30個(gè)循環(huán) 3.72℃ 10分鐘 4.取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳 2)、PCR反應(yīng)體系：約5小時(shí) 25mM MgCl2 3μl 10×PCR 緩沖液 5μl 10mM dNTP 1μl 上下游引物10pmol/μl 2.5μl×2 CDNA模板 5μl ddH2O 30μl Taq酶 1μl 輕質(zhì)石蠟油 50μl 100μl 1.94℃ 2分鐘，55℃ 1分鐘，72℃ 2分鐘 為第一個(gè)步1個(gè)循環(huán) 2.94℃ 45秒，50℃ 40秒，72℃ 1分鐘 為第二步40個(gè)循環(huán) 3. 72℃ 10分鐘 4. 取出后4℃ 5分鐘后-20℃保存或走電泳 四、電泳：約1.25小時(shí) 1. 配0.5×TBE電泳緩沖液300 ml 2.膠濃度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68g膠） 3.微波爐中火2分鐘溶解膠 4.冷卻至60℃加入溴乙錠2μl（10mg/ml的終濃度0.5μg/ml） |
3樓2013-03-27 13:41:58
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