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xjtu0025

新蟲(chóng) (小有名氣)

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[求助] 雙酶切體系構(gòu)建新手！

我是要做載體和目的產(chǎn)物鏈接
選的是ECOR1 和Xba I
TAKARA的
看了說(shuō)明書(shū)，發(fā)現(xiàn)buffer不同啊。。。盡管是同一個(gè)溫度下的，37.
這樣我要怎么做呢？
EcoRI
體系
EcoR I 1 μl
10×H Buffer 2 μl
DNA ≤1 μg
滅菌水 up to 20 μl

10 × H
500mM Tris-HCl,
100mM MgCl2
10mM Dithiothreitol
1,000mM NaC

XbaI
體系
Xba I 1 μl
10×M Buffer 2 μl
0.1% BSA 2 μl
DNA ≤1 μg
滅菌水 up to 20 μl

10 × M
100mM Tris-HCl,pH7.5
100 mM MgCl2
10mM Dithiothreitol
500mM NaCl

XbaI的那個(gè)還要加BSA

我不能換了呀。。因?yàn)槟康幕虻拿盖形稽c(diǎn)是pcr加上去的，前后多加了3個(gè)保護(hù)堿基。引物都設(shè)計(jì)好了，就等RNA一提出來(lái)，RTPCR一步式完以后直接切了再酶連的。。老師會(huì)殺了我的。。我只是本科畢業(yè)論文，沒(méi)人教我。都是自己摸索的。。

難道要分步酶切再回收？重點(diǎn)是我現(xiàn)在那個(gè)產(chǎn)物的量還不好說(shuō)，這樣會(huì)不會(huì)很浪費(fèi)產(chǎn)物？最后我要做克隆載體的。。

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1樓 2013-04-02 16:50:44

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酶切專家

金蟲(chóng) (小有名氣)

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myprayer: 金幣+2, 贈(zèng)人玫瑰手有余香。生物版塊歡迎你的無(wú)私奉獻(xiàn)。 2013-04-03 08:40:15

如果是新手，可以考慮用double digestion disigner,完全控制你的雙酶切，推薦雙酶切buffer，精確計(jì)算酶的用量，保證載體和外源片段酶切完全。http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/showresult.php

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4樓2013-04-02 22:52:06

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ytxy

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myprayer: 金幣+2, 鼓勵(lì)應(yīng)助，分子生物版塊，期待你的精彩。 2013-04-03 08:39:46

這是要畢業(yè)了嗎，才開(kāi)始做PCR？
可以分步酶切的：先用EcorI體系切（20ul)，切完擴(kuò)大體系（比如30或40ul),按照XbaI體系切。你也可以買NEB的酶，好像兩種酶是同一種buffer。
貌似你還沒(méi)PCR？要是有非特異帶你還得先割膠回收。

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2樓2013-04-02 17:37:02

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引用回帖:

2樓: Originally posted by ytxy at 2013-04-02 17:37:02
這是要畢業(yè)了嗎，才開(kāi)始做PCR？
可以分步酶切的：先用EcorI體系切（20ul)，切完擴(kuò)大體系（比如30或40ul),按照XbaI體系切。你也可以買NEB的酶，好像兩種酶是同一種buffer。
貌似你還沒(méi)PCR？要是有非特異帶你還得先 ...

別提了，我養(yǎng)了一個(gè)月的細(xì)胞都沒(méi)有用。因?yàn)槿ツ陜龃娴募?xì)胞全部都是污染和死掉的，上個(gè)禮拜老師才找來(lái)新的細(xì)胞。這兩天才開(kāi)始提總RNA。
實(shí)驗(yàn)室很不健全，所有試劑材料都要自己配，重新買。還有很多都是過(guò)期的，老師也是不給用新的。

我找到TAKARA的里面雙酶切的buffer了。

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3樓2013-04-02 19:00:26

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