陳彥利

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[交流] 基因克隆失敗原因，求助！

我們要克隆一個(gè)目的基因，結(jié)果PCR后電泳根本就沒有條帶，為什么呀，請(qǐng)高手幫忙分析原因

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1樓 2013-04-27 14:40:22

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cicelyzh

鐵桿木蟲 (職業(yè)作家)

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從什么模板克隆，基因組還是cDNA？模板是否有問題，PCR是否設(shè)置了正對(duì)照？引物的退火溫度是否進(jìn)行了優(yōu)化？

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2樓2013-04-27 14:50:06

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陳彥利(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-04-27 15:09:07

體系中模板、引物、dntp、水都有可能有問題，還有鎂離子濃度

程序中退火溫度也比較重要，你什么都沒有給，不好說��！

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3樓2013-04-27 14:54:01

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我很快樂3A87

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我最近也正在做3'race，跑了好幾次也沒結(jié)果，好像最后都只是引物二聚體。maker本來應(yīng)該點(diǎn)2000bp的，結(jié)果點(diǎn)錯(cuò)了點(diǎn)成15000的，目的片段本應(yīng)該是400-500bp，請(qǐng)各位高手幫我分析分析這個(gè)電泳圖，謝了。

B1[LMTHM4J4PP%}5_Y7BJ[8.jpg

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4樓2013-04-27 15:11:25

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陳彥利

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引用回帖:

2樓: Originally posted by cicelyzh at 2013-04-27 14:50:06
從什么模板克隆，基因組還是cDNA？模板是否有問題，PCR是否設(shè)置了正對(duì)照？引物的退火溫度是否進(jìn)行了優(yōu)化？

　　以反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，F(xiàn)orward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加入下列試劑：
反應(yīng)體系          25uL
Tamplate cDNA    0.75uL
ddH2O             16.5uL
10×PCR Buffer    2.5uL
Mg2+             1uL
dNTP             2uL
primer  Forward    1uL
   Reverse    1uL
Taq                0.25uL

設(shè)定PCR程序：
PCR循環(huán):
94℃ 預(yù)變性5min
94℃ 60s
55℃ 60s 30個(gè)循環(huán)
72℃ 90s
72℃ 10min
4℃ 保存。
電泳鑒定：采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，其中電泳加樣體積均為10uLDNAMarker為D2000。紫外燈下觀察結(jié)果。
　　拍照觀察：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳圖條帶進(jìn)行拍照分析。

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5樓2013-04-27 15:13:06

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引用回帖:

3樓: Originally posted by 德國工兵鏟 at 2013-04-27 14:54:01
體系中模板、引物、dntp、水都有可能有問題，還有鎂離子濃度

程序中退火溫度也比較重要，你什么都沒有給，不好說啊！

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6樓2013-04-27 15:13:19

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陳彥利(gyesang代發(fā)): 金幣+1, 鼓勵(lì)應(yīng)助交流！ 2013-04-28 03:03:03

如果你確定模板沒有問題（就是前期RNA提的不錯(cuò)，反轉(zhuǎn)錄也沒有問題），你可以先做一個(gè)退火溫度梯度。因?yàn)槟阌缅e(cuò)了MARKER，從電泳圖上也看不清楚。你電泳時(shí)間應(yīng)該比較長了，如果目的條帶很弱的話，有可能就看不到了。

另外，用5ul點(diǎn)樣就可以了，不用那么多的，上樣量太多跑的條帶不好看。

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7樓2013-04-27 16:08:22

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gyesang: 金幣+1, 鼓勵(lì)回帖交流！ 2013-04-28 03:03:16

引用回帖:

5樓: Originally posted by 陳彥利 at 2013-04-27 15:13:06
　　以反轉(zhuǎn)錄得到的雙鏈cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，F(xiàn)orward primer：5’-GGCATCCATGTCGCATCTGT-3’；Reverse primer :5’-TCTGACCCTATTGAGCCCTCT-3’。通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因OspHT7。
取0.5ml PCR管，一次加 ...

是否檢測了cDNA模板的濃度？此外，引物是否好用？PCR時(shí)是否做了其它基因?yàn)閷?duì)照？鎂離子、引物、dNTP的濃度是多少？

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9樓2013-04-28 02:58:03

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sd3824289

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

中間有可能存在的問題有很多，不過建議你可以試一下PCR Mix，如果樓主要克隆的目的片段較大，還是建議用pfu taq酶，提高保真性！如果還是不行建議樓主從引物角度考慮一下，換一下引物什么的！祝試驗(yàn)順利！

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10樓2013-04-29 14:14:31

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zhyn2012

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小木蟲: 金幣+0.5, 給個(gè)紅包，謝謝回帖

30個(gè)循環(huán)是在第幾步上啊

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11樓2013-04-29 16:06:15

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yingying15888樓

2013-04-27 17:29 回復(fù)

陳彥利(金幣+1): 謝謝參與

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