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jingyko銅蟲(chóng) (初入文壇)
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[交流]
畢赤酵母GS115胞內(nèi)表達(dá) 求助
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本人現(xiàn)在在做畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)。酵母用的gs115，載體用的是ppic3.5k。用sal1線性化，插入his4位點(diǎn)。 在篩選出重組子后，做誘導(dǎo)，破碎酵母提取蛋白后做western發(fā)現(xiàn)無(wú)論是加甲醇還是不加的，都有蛋白的表達(dá)，而且表達(dá)量視乎沒(méi)有差異（看western的信號(hào)強(qiáng)度很接近）。 我懷疑是不是重組子沒(méi)有篩選好，就提取了基因組做pcr驗(yàn)證 ，用的引物是5-AOX1和3-AOX1.然后疑惑了 沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)手冊(cè)上的2條帶。 ppic3.5k ，和ppic3.5k-目的基因，只有200-300 的帶。gs115有一天2。2k的帶。但是都沒(méi)有目的基因860左右的帶。哪位老師能幫我分析下，200-300的帶是怎么回事？怎么樣能驗(yàn)證插入了進(jìn)去（我只是利用的是營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選的）？ 20130503pcr_副本.jpg |
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