 |
 |
 |
 |
 |
 |
||
 |
 |
 |
 |
 |
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 查看: 1569 | 回復(fù): 2 | ||
佛法無(wú)邊新蟲(chóng) (初入文壇)
|
[求助]
PET-22b原核表達(dá)載體構(gòu)建
|
|
本人才本科生超級(jí)菜鳥(niǎo)剛剛開(kāi)始做原核表達(dá)，正在用PET-22b構(gòu)建表達(dá)載體，基因整合在Puc-57質(zhì)粒上。目的基因兩端分別有HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)一共450bp左右，質(zhì)粒是用magen公司的試劑盒提取的，PET-22b提的效果不理想，估算我酶切后的質(zhì)粒濃度超不過(guò)20ng/μl，基因小于10ng/μl。 酶切體系：（takara的酶） 連接體系（NEB的T4 DNA Ligase） 10x M buffer 2ul 10x buffer 2ul 水 6ul 水 2ul 質(zhì)粒 10ul 基因 10ul HindIII 1ul 載體 5ul EcoRI 1ul 酶 1ul 酶切37℃ 3h 連接16℃2小時(shí)（我估算基因與載體摩爾比10:1） 實(shí)驗(yàn)室暫且沒(méi)有BL21就先轉(zhuǎn)化DH5α了，陽(yáng)性對(duì)照轉(zhuǎn)成了，實(shí)驗(yàn)組一直沒(méi)成功，求大神改進(jìn)酶切、連接體系的指導(dǎo)。（本人超級(jí)菜頭一次提問(wèn)求大神們別笑話） |
回復(fù)此樓» 猜你喜歡
蛋白質(zhì)檢測(cè)：精準(zhǔn)分析，解鎖生物分子的密碼
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之小鼠實(shí)驗(yàn)：嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)，解析生命機(jī)制的重要載體
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
化學(xué)工程及工業(yè)化學(xué)論文潤(rùn)色/翻譯怎么收費(fèi)?
已經(jīng)有106人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之重金屬檢測(cè)：精準(zhǔn)篩查，守護(hù)健康與環(huán)境的防線
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“蛙測(cè)重金屬我背鍋三千”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
不合理蛙科研實(shí)驗(yàn)之“鼠逃三次我發(fā)三篇SCI”
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
納米粒度分析
已經(jīng)有3人回復(fù)
-
林科院林化所招收材料與化工專(zhuān)業(yè)碩士，坐標(biāo)南京
已經(jīng)有0人回復(fù)
-
留學(xué)--博士招生
已經(jīng)有16人回復(fù)
-
化學(xué)工程，本211，求調(diào)劑，ab區(qū)不限
已經(jīng)有4人回復(fù)
» 本主題相關(guān)商家推薦: (我也要在這里推廣)
» 本主題相關(guān)價(jià)值貼推薦，對(duì)您同樣有幫助:
- pET-22b構(gòu)建好了質(zhì)粒，表達(dá)不出來(lái)？
已經(jīng)有7人回復(fù)
- 原核表達(dá)載體蛋白誘導(dǎo)
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 原核表達(dá)和SDS-PAGE
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
已經(jīng)有37人回復(fù)
- 原核表達(dá)蛋白變小
已經(jīng)有4人回復(fù)
- 蛋白激酶原核表達(dá)
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 真核表達(dá)載體 原核 區(qū)別與擴(kuò)增
已經(jīng)有8人回復(fù)
- 原核表達(dá) pET32a和pET30a Western blot問(wèn)題
已經(jīng)有9人回復(fù)
- 原核表達(dá)形成了包涵體怎么辦�。�
已經(jīng)有22人回復(fù)
- 兩個(gè)基因融合構(gòu)建真核表達(dá)載體需要去掉信號(hào)肽嗎?
已經(jīng)有7人回復(fù)
- pET-28a原核不能表達(dá)目的蛋白
已經(jīng)有17人回復(fù)
- 原核表達(dá) PET-30載體 目的蛋白分子量偏��？
已經(jīng)有18人回復(fù)
- 原核表達(dá)問(wèn)題
已經(jīng)有14人回復(fù)
- 【求助/交流】酵母表達(dá)和原核表達(dá)，在技術(shù)上有什么不同？
已經(jīng)有6人回復(fù)
- 【求助/交流】連接表達(dá)載體PET-28A失敗原因
已經(jīng)有23人回復(fù)
- 【求助/交流】原核表達(dá)載體pGEX-4T-1對(duì)應(yīng)的表達(dá)菌株
已經(jīng)有6人回復(fù)
haitian0625
金蟲(chóng) (小有名氣)
- 應(yīng)助: 7 (幼兒園)
- 金幣: 1392.4
- 帖子: 123
- 在線: 56.9小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 903890
- 注冊(cè): 2009-11-15
- 性別: GG
- 專(zhuān)業(yè): 基因表達(dá)調(diào)控與表觀遺傳學(xué)
2樓2013-05-12 19:50:43
cicelyzh
鐵桿木蟲(chóng) (職業(yè)作家)
- MolEPI: 10
- 應(yīng)助: 1662 (講師)
- 金幣: 8693.8
- 紅花: 72
- 帖子: 3516
- 在線: 456小時(shí)
- 蟲(chóng)號(hào): 1614001
- 注冊(cè): 2012-02-13
- 專(zhuān)業(yè): 生物化學(xué)
|
酶切時(shí)考慮到回收的損失，質(zhì)粒的用量一般在1-3μg。做酶切時(shí)需要電泳檢測(cè)酶切完全，目的基因小片段需要切膠回收。載體可以直接回收�；厥占兓钠涡枰�。實(shí)在無(wú)法準(zhǔn)確定量的話可以把回收的片段跑膠，根據(jù)marker亮度估算濃度。定量后根據(jù)片段大小和摩爾比建立連接體系。 此外，做克隆時(shí)本來(lái)就應(yīng)該轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定正確后質(zhì)粒也一般是保存在DH5α里。BL21是做表達(dá)蛋白時(shí)才用的，不適宜長(zhǎng)期保存質(zhì)粒。把鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21后直接做表達(dá)。 |
3樓2013-05-12 22:56:46
相關(guān)版塊跳轉(zhuǎn)
我要訂閱樓主 佛法無(wú)邊 的主題更新
| 3 | 1/1 | 返回列表 |
| 最具人氣熱帖推薦 [查看全部] | 作者 | 回/看 | 最后發(fā)表 | |
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 304求調(diào)劑 +5 | 曼殊2266 2026-03-27 | 5/250 |
|
|---|---|---|---|---|
|
[考研] 266分，求材料冶金能源化工等調(diào)劑 +6 | 哇呼哼呼哼 2026-03-27 | 8/400 |
|
|
|
[考研] 340求調(diào)劑 +5 | jhx777 2026-03-27 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 070300化學(xué)求調(diào)劑 +4 | 起個(gè)名咋這么難 2026-03-27 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 265求調(diào)劑11408 +3 | 劉小鹿lu 2026-03-27 | 3/150 |
|
|
|
[考研] 322求調(diào)劑 +4 | 我真的很想學(xué)習(xí) 2026-03-23 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑，一志愿 南京航空航天大學(xué)大學(xué) ，080500材料科學(xué)與工程學(xué)碩 +4 | @taotao 2026-03-26 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 321求調(diào)劑 +6 | Ymlll 2026-03-24 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 329求調(diào)劑 +5 | 1() 2026-03-22 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 271求調(diào)劑 +6 | 生如夏花… 2026-03-22 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 297求調(diào)劑 +6 | 田洪有 2026-03-26 | 6/300 |
|
|
|
[考研] 調(diào)劑310 +3 | 溫柔的晚安 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 299求調(diào)劑 +4 | 15188958825 2026-03-25 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 318求調(diào)劑 +5 | plum李子 2026-03-21 | 8/400 |
|
|
|
[有機(jī)交流]
 有機(jī)合成求助
 20+3
|
FENGSHUJEI 2026-03-23 | 5/250 |
|
|
|
[考研] 求調(diào)劑 +6 | 研研，接電話 2026-03-24 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 305分求調(diào)劑（食品工程） +5 | Sxy112 2026-03-21 | 7/350 |
|
|
|
[考研] 一志愿河北工業(yè)大學(xué)0817化工278分求調(diào)劑 +7 | jhybd 2026-03-23 | 12/600 |
|
|
|
[考研] 276求調(diào)劑 +3 | YNRYG 2026-03-21 | 4/200 |
|
|
|
[考研] 一志愿北京化工大學(xué)070300 學(xué)碩336求調(diào)劑 +5 | vv迷 2026-03-21 | 8/400 |
|