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佛法無邊新蟲 (初入文壇)
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[求助]
PET-22b原核表達(dá)載體構(gòu)建
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本人才本科生超級菜鳥剛剛開始做原核表達(dá)，正在用PET-22b構(gòu)建表達(dá)載體，基因整合在Puc-57質(zhì)粒上。目的基因兩端分別有HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)一共450bp左右，質(zhì)粒是用magen公司的試劑盒提取的，PET-22b提的效果不理想，估算我酶切后的質(zhì)粒濃度超不過20ng/μl，基因小于10ng/μl。 酶切體系：（takara的酶） 連接體系（NEB的T4 DNA Ligase） 10x M buffer 2ul 10x buffer 2ul 水 6ul 水 2ul 質(zhì)粒 10ul 基因 10ul HindIII 1ul 載體 5ul EcoRI 1ul 酶 1ul 酶切37℃ 3h 連接16℃2小時(shí)（我估算基因與載體摩爾比10:1） 實(shí)驗(yàn)室暫且沒有BL21就先轉(zhuǎn)化DH5α了，陽性對照轉(zhuǎn)成了，實(shí)驗(yàn)組一直沒成功，求大神改進(jìn)酶切、連接體系的指導(dǎo)。（本人超級菜頭一次提問求大神們別笑話） |
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haitian0625
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2樓2013-05-12 19:50:43
cicelyzh
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酶切時(shí)考慮到回收的損失，質(zhì)粒的用量一般在1-3μg。做酶切時(shí)需要電泳檢測酶切完全，目的基因小片段需要切膠回收。載體可以直接回收。回收純化的片段需要定量。實(shí)在無法準(zhǔn)確定量的話可以把回收的片段跑膠，根據(jù)marker亮度估算濃度。定量后根據(jù)片段大小和摩爾比建立連接體系。 此外，做克隆時(shí)本來就應(yīng)該轉(zhuǎn)化DH5α，鑒定正確后質(zhì)粒也一般是保存在DH5α里。BL21是做表達(dá)蛋白時(shí)才用的，不適宜長期保存質(zhì)粒。把鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21后直接做表達(dá)。 |
3樓2013-05-12 22:56:46
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