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安小安4302鐵蟲 (正式寫手)
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[求助]
求鎳柱子純化表達蛋白的具體步驟，注意事項�。�！
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如題 本科大三第一次做，老師也不了解，請教了別的老師，但具體還是要查，求有經(jīng)驗的蟲蟲給講講�。� |
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2樓2013-05-21 08:09:16
★
myprayer: 金幣-1, 請勿單純表情回復。。。下不為例，謝謝合作， 2013-05-21 13:24:15
myprayer: 金幣-1, 請勿單純表情回復。。。下不為例，謝謝合作， 2013-05-21 13:24:15
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3樓2013-05-21 08:38:38
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4樓2013-05-21 14:36:17
xbl3688
銀蟲 (正式寫手)
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- 專業(yè): 生物大分子結(jié)構(gòu)與功能
【答案】應助回帖
★ ★ ★
感謝參與，應助指數(shù) +1
安小安4302: 金幣+3, 謝謝 2013-05-21 18:52:00
感謝參與，應助指數(shù) +1
安小安4302: 金幣+3, 謝謝 2013-05-21 18:52:00
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1、 過柱前的注意事項： a、 樣品必須澄清、無顆粒物，否則會堵塞柱子、縮短其使用壽命； b、 包含體洗滌的最后一步及溶解時所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME； c、 確保樣品及Binding Buffer中有適量的NaCl，以防止雜離子與Ni離子競爭； 2、 過Ni柱的操作步驟： a、用去離子水洗滌，洗去20％的乙醇、除盡基質(zhì)中的空氣，并能防止下一步中Ni離子沉淀； b、5×柱體積的Charge Buffer（50mM NiSO4）充電； c、5×柱體積的去離子水洗滌，去游離的Ni離子； d、 10×柱體積的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡； e、 上樣（手工上樣，樣品體積應根據(jù)目的蛋白的濃度來確定）； f、 20×柱體積的Washing Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,20-50mM咪唑，pH8.0）洗滌，至無蛋白檢出，收集流出液； g、 Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脫，每次1ml，應呈現(xiàn)正態(tài)分布（兩邊稀，中間濃）； h、 10×柱體積的Binding Buffer洗滌。此時，即可用于純化同種蛋白，很少需要重新充電。 注：同種蛋白純化5～10次后，應進行strip和re-charge。 3、柱的清洗與保存： a、去Ni離子：a、5×柱體積的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗滌；b、10×柱體積的去離子水洗滌。 b、去沉淀的蛋白質(zhì)：a、5×柱體積的0.5M NaOH裝滿柱子，靜置0.5～2hr；b、去離子水洗滌，至流出液的pH值為7。 c、保存：20％乙醇洗滌，再加20％乙醇保存于4℃。 |
5樓2013-05-21 15:23:54
91candy
鐵蟲 (小有名氣)
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6樓2015-05-04 16:04:14
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